背景[1-6]
Thermo Scientific PageBlue Protein Staining Solution是一種靈敏，經(jīng)濟(jì)的膠體考馬斯G-250染料配方，用于聚丙烯酰胺凝膠和不含甲醇或乙酸的PVDF膜上蛋白質(zhì)的終點(diǎn)染色。
簡(jiǎn)單的PageBlue蛋白質(zhì)染色溶液方案靈敏，高效，即使在過(guò)夜染色后也消除了過(guò)度染色凝膠的擔(dān)憂。這種蛋白質(zhì)染色劑的動(dòng)態(tài)范圍為5至500ng，比傳統(tǒng)的考馬斯R-250染料靈敏度高約10倍。此外，PageBlue蛋白質(zhì)染色解決方案是經(jīng)濟(jì)的，因?yàn)樗梢灾貜?fù)使用多達(dá)三次而不會(huì)有任何靈敏度損失。
特點(diǎn)[3-6]
PageBlue蛋白染色液的特點(diǎn)：
•易于使用-只需將凝膠浸泡在即用型溶液中，觀察染色條帶，不會(huì)脫色
•快速25至40分鐘方案
•安全-不含甲醇或乙酸
•動(dòng)態(tài)范圍-線性動(dòng)態(tài)范圍5至500ng
•經(jīng)濟(jì)-可重復(fù)使用3次
簡(jiǎn)單的PageBlue蛋白質(zhì)染色溶液方案靈敏，高效，即使在過(guò)夜染色后也消除了過(guò)度染色凝膠的擔(dān)憂。這種蛋白質(zhì)染色劑的動(dòng)態(tài)范圍為5至500ng，比傳統(tǒng)的考馬斯R-250染料靈敏度高約10倍。此外，PageBlue蛋白質(zhì)染色解決方案是經(jīng)濟(jì)的，因?yàn)樗梢灾貜?fù)使用多達(dá)三次而不會(huì)有任何靈敏度損失。
應(yīng)用[7][8]
用于可視化和量化在1D，2D和IEF聚丙烯酰胺凝膠中分離的蛋白質(zhì)轉(zhuǎn)移到PVDF膜上后的染色。
在線粒體融合參與營(yíng)養(yǎng)缺乏環(huán)境肝癌細(xì)胞糖代謝重編程調(diào)控的作用與機(jī)制研究中利用qrt-pcr與westernblot實(shí)驗(yàn),檢測(cè)營(yíng)養(yǎng)缺乏環(huán)境下參與線粒體分裂/融合調(diào)控的關(guān)鍵分子及其上游信號(hào)分子的表達(dá)與活性,分析營(yíng)養(yǎng)缺乏環(huán)境促進(jìn)線粒體融合的分子機(jī)制。利用qrt-pcr、westernblot與gc-ms(氣相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用)技術(shù),分析營(yíng)養(yǎng)缺乏時(shí)線粒體融合對(duì)肝癌細(xì)胞糖酵解與氧化磷酸的調(diào)控。線粒體是調(diào)控細(xì)胞代謝最重要的細(xì)胞器,通過(guò)不斷地分裂/融合調(diào)控自身功能并對(duì)外界刺激做出適應(yīng)性反應(yīng)。
利用tem(透射電鏡)、bluenative-page、co-ip、qrt-pcr與westernblot技術(shù),對(duì)營(yíng)養(yǎng)缺乏時(shí)線粒體融合調(diào)控氧化磷酸化與糖酵解的機(jī)制進(jìn)行研究。5.利用fcm(流式細(xì)胞術(shù))與克隆形成實(shí)驗(yàn),分析營(yíng)養(yǎng)缺乏時(shí)線粒體融合對(duì)肝癌細(xì)胞存活的影響。大量研究證實(shí),線粒體分裂/融合異常與多種神經(jīng)退行性疾病、心血管疾病及代謝性疾病的發(fā)生進(jìn)展密切相關(guān)。近年來(lái)研究證實(shí),多種類型腫瘤中線粒體分裂/融合發(fā)生異常,并參與腫瘤惡性進(jìn)展。實(shí)體瘤常由于生長(zhǎng)過(guò)快而導(dǎo)致內(nèi)部出現(xiàn)慢性營(yíng)養(yǎng)缺乏微環(huán)境,腫瘤細(xì)胞需感知并通過(guò)代謝重編程做出適應(yīng)才能繼續(xù)生存,而目前腫瘤適應(yīng)營(yíng)養(yǎng)缺乏的機(jī)制仍不十分清楚,闡明其機(jī)制對(duì)腫瘤防治具有重大意義。
我們前期研究發(fā)現(xiàn),營(yíng)養(yǎng)缺乏環(huán)境時(shí)肝癌細(xì)胞線粒融合變長(zhǎng)。作為細(xì)胞能量代謝調(diào)控核心的線粒體,其形態(tài)結(jié)構(gòu)的變化是否參與肝癌細(xì)胞在營(yíng)養(yǎng)缺乏時(shí)的代謝適應(yīng)尚不清楚。
結(jié)果:
1.mito-tracker熒光染色證實(shí)營(yíng)養(yǎng)缺乏促進(jìn)肝癌細(xì)胞線粒體融合變長(zhǎng);透射電鏡(tem)對(duì)肝癌組織線粒體形態(tài)觀察發(fā)現(xiàn),腫瘤中心區(qū)(營(yíng)養(yǎng)缺乏)較邊緣區(qū)(營(yíng)養(yǎng)充足)線粒體變長(zhǎng)。
2.營(yíng)養(yǎng)缺乏時(shí),線粒體分裂/融合調(diào)控關(guān)鍵分子drp1、fis1、mfn1、mfn2與opa1表達(dá)均未發(fā)生顯著變化,而線粒體定位的drp1因被pka磷酸化(s637)而減少,導(dǎo)致線粒體變長(zhǎng)。
3.營(yíng)養(yǎng)缺乏時(shí),線粒體融合促進(jìn)肝癌細(xì)胞氧化磷酸而抑制糖酵解。
4.營(yíng)養(yǎng)缺乏時(shí),線粒體融合通過(guò)使線粒體嵴緊密促進(jìn)氧化呼吸鏈復(fù)合體組裝,從而激活氧化磷酸化而抑制糖酵解;線粒體融合通過(guò)氧化磷酸化介導(dǎo)的nad+/sirt1/hif-1α信號(hào)抑制糖酵解。
5.線粒體融合抑制肝癌細(xì)胞在營(yíng)養(yǎng)缺乏環(huán)境下的凋亡,促進(jìn)肝癌細(xì)胞克隆形成能力。
6.營(yíng)養(yǎng)缺乏誘導(dǎo)的線粒體融合促進(jìn)腫瘤生長(zhǎng)。
7.介導(dǎo)營(yíng)養(yǎng)缺乏環(huán)境下線粒體融合的關(guān)鍵分子p-drp1s937表達(dá)水平與肝癌患者腫瘤分級(jí)、tnm分期及血清afp水平正相關(guān),與患者預(yù)后顯著負(fù)相關(guān)性。
參考文獻(xiàn)
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