背景[1-6]
SimplyBlue SafeStain是一種即用型的快速、靈敏且安全的Coomassie®G-250染料(Coomassie®G-250 stain)，用于對聚丙烯酰胺凝膠分離的蛋白質條帶進行染色。該染料消除了制備染色溶液所需的大量時間和成本。
與傳統(tǒng)R-250和某些G-250 Coomassie®染料(G-250 Coomassie®stain)不同的是，SimplyBlue™SafeStain對人體完全無害，并且無需甲醇或乙酸固定劑或脫色劑。避免了接觸有毒物質和難聞氣味的風險，創(chuàng)造更健康的實驗室環(huán)境。
操作步驟[1-6]
SimplyBlue SafeStain一般用于1.0毫米和1.5毫米Tris-甘氨酸凝膠，1.0毫米Tricine，酶譜和IEF迷你凝膠（8 x 8厘米）。電泳后，請按照以下說明操作。確保迷你凝膠在水中或污漬中自由移動，以便在所有步驟中擴散。用100ml去離子水沖洗微型凝膠3次，每次5分鐘，以除去SDS和緩沖鹽，這會干擾染料與蛋白質的結合。丟棄每次沖洗。用足夠的SimplyBlue™SafeStain（20-100 ml）染色迷你凝膠以覆蓋凝膠。在室溫下輕輕搖動1小時。
將在幾分鐘內開始發(fā)展。孵育后，丟棄污漬。污漬不能重復使用。注意：凝膠可以染色長達3小時，但3小時后，敏感度會降低。如果您需要將凝膠在污漬中過夜，每20毫升污漬中加入2毫升20％NaCl（w/v）水溶液。此過程不會影響靈敏度。用100毫升水洗滌微型凝膠1-3小時。凝膠可以在水中放置數天而不會損失靈敏度。水中有少量染料與結合在蛋白質上的染料達到平衡，因此蛋白質將保持藍色。為了獲得最清晰的攝影背景，用100毫升水進行第二次1小時的洗滌。
注意：如果凝膠在水中停留超過1天，靈敏度現(xiàn)在會降低。減少水中的游離染料有利于染料從蛋白質中解離。如果您需要將凝膠在水中存放幾天，請加入20毫升20％NaCl。
應用[7][8]
用于蜱唾液腺蛋白Salp20的補體抑制機制和卵黃發(fā)生的激素調控研究中WB實驗中的蛋白染色。
蜱唾液腺蛋白Salp20能保護萊姆病血清敏感型病原體伽氏疏螺旋體（B.garinii）免受補體介導的裂解。本文表達純化了蜱唾液腺蛋白Salp20，對其分離純化條件進行了優(yōu)化，并對其補體抑制機制進行了研究。該研究對蜱媒疾病防治和畜牧業(yè)發(fā)展具有重要的理論和實際應用意義。優(yōu)化后的分離條件為：500ml樣品量流經500μl的Ni-NTA親和層析柱，用2ml含有20mM咪唑的緩沖液清洗四次，用250μl含有500mM咪唑的洗脫液洗脫四次并收集樣品。SDS-PAGE和Western blot分析所得蛋白樣品，結果顯示蛋白具有高純度且為目的蛋白Salp20。純化的Salp20能夠保護伽氏疏螺旋體免受補體裂解，證明分離純化所得蛋白具有很高的生物學活性。用C3b單克隆抗體檢測萊姆病病原體表面C3b的沉積，免疫熒光分析結果顯示血清敏感型病原體伽氏疏螺旋體表面有大量的C3b沉積，而血清抗型伯格多弗疏螺旋體表面C3b沉積量極少。
說明血清敏感型病原體伽氏疏螺旋體能夠引發(fā)強烈的補體反應，而血清抗型伯格多弗疏螺旋體不能。用C3b和P因子單克隆抗體檢測伽氏疏螺旋體表面補體替代途徑中C3b和P因子的沉積，免疫熒光分析結果顯示菌體表面有大量的C3b和P因子沉積，說明伽氏疏螺旋體引發(fā)了強烈的補體替代途徑反應。向反應體系加入10μg/ml Salp20后，菌體表面沒有C3b和P因子沉積，說明Salp20可抑制補體替代途徑中的C3b和P因子結合到伽氏疏螺旋體表面。伽氏疏螺旋體與10μg/ml P因子反應后，菌體表面無P因子的沉積。伽氏疏螺旋體與C3缺失型人血清反應后，發(fā)現(xiàn)菌體表面無P因子。表明P因子不能直接與伽氏疏螺旋體表面結合來起始補體替代途徑。
因此Salp20通過P因子結合，使其不能穩(wěn)定C3轉化酶，抑制了C3b蛋白的產生，從而抑制了補體替代途徑。研究了兩種激素20-羥基蛻皮酮（20-hydroxyecdysone，20E）和保幼激素III（juvenile hormone III，JH III）對長角血蜱（Haemaphysalis longicornis）孤雌生殖種群卵黃發(fā)生的影響，對揭示蜱類生殖生物學規(guī)律和蜱類防治具有重要的科學意義。
參考文獻
[1]Morphological,biological and molecular characteristics of bisexual and parthenogenetic Haemaphysalis longicornis[J].Ze Chen,Xiaojun Yang,Fengju Bu,Xiaohong Yang,Jingze Liu.Veterinary Parasitology.2012(2-4)
[2]A Tick Mannose-Binding Lectin Inhibitor Interferes with the Vertebrate Complement Cascade to Enhance Transmission of the Lyme Disease Agent[J].Tim J.Schuijt,Jeroen Coumou,Sukanya Narasimhan,Jianfeng Dai,Kathleen DePonte,Diana Wouters,Mieke Brouwer,Anneke Oei,Joris J.T.H.Roelofs,Alje P.van Dam,Tom van der Poll,Cornelis van’t Veer,Joppe W.Hovius,Erol Fikrig.Cell Host&Microbe.2011(2)
[3]Effect of 20-hydroxyecdysone and haemolymph on oogenesis in the ixodid tick Amblyomma hebraeum[J].Adriana Seixas,Kevin J.Friesen,W.Reuben Kaufman.Journal of Insect Physiology.2008(7)
[4]Cloning and characterization of a cDNA clone encoding calreticulin from Haemaphysalis qinghaiensis(Acari:Ixodidae)[J].Jinliang Gao,Jianxun Luo,Ruiquan Fan,Volker Fingerle,Guiquan Guan,Zhijie Liu,Youquan Li,Haiping Zhao,Miling Ma,Junlong Liu,Aihong Liu,Qiaoyun Ren,Zhisheng Dang,Chihiro Sugimoto,Hong Yin.Parasitology Research.2008(4)
[5]The Structure of OMCI,a Novel Lipocalin Inhibitor of the Complement System[J].Pietro Roversi,Olga Lissina,Steven Johnson,Nurfilza Ahmat,Guido C.Paesen,Kerstin Ploss,Wilhelm Boland,Miles A.Nunn,Susan M.Lea.Journal of Molecular Biology.2007(3)
[6]Differential anti‐chemokine activity of Amblyomma variegatum adult ticks during blood‐feeding[J].Parasite Immunology.2007(4)
[7]Boophilus microplus:Its saliva contains microphilin,a small thrombin inhibitor[J].Alessandra Ciprandi,Simone Kobe de Oliveira,Aoi Masuda,Fabiana Horn,Carlos Termignoni.Experimental Parasitology.2006(1)
[8]楊曉紅.蜱唾液腺蛋白Salp20的補體抑制機制和卵黃發(fā)生的激素調控[D].河北師范大學,2013.