背景技術(shù)

目前酶免疫分析(EIA)技術(shù)，已被廣泛應(yīng)用于抗原，半抗原或抗體的定量或定性檢測分析。辣根過氧化物酶(HRP)及其偶聯(lián)物是酶聯(lián)免疫分析技術(shù)中常用的一種酶，由于3,3',5,5'-四甲基聯(lián)苯胺鹽酸鹽(TMB)在HRP的顯色反應(yīng)體系中，比其它色原具有更高的靈敏度且無致癌性而被廣泛應(yīng)用。TMB主要應(yīng)用于酶聯(lián)免疫吸附實驗(ELISA)，免疫斑點雜交或者免疫組化以及氯和過氧化氫的檢測分析。

3,3',5,5'-四甲基聯(lián)苯胺及3,3',5,5'-四甲基聯(lián)苯胺鹽酸鹽或其中間體的合成報道，目前還比較少，主要有以下幾種方法。

以4-溴-2,6-二甲基苯胺為原料，通過鈀碳等進(jìn)行偶聯(lián)，得到3,3',5,5'-四甲基聯(lián)苯胺。以2,6-二甲基苯胺為原料，通過氧化、還原、重排反應(yīng)為得到3,3',5,5'-四甲基聯(lián)苯胺及3,3',5,5'-四甲基聯(lián)苯胺鹽酸鹽。專利CN1056304用赤血鹽氧化，用氯化銨鋅粉體系還原，用鹽酸重排合成；蘇聯(lián)專利RU2086536用雙氧水做氧化劑，用氯化銨鋅粉體系還原，用硫酸重排合成。CN107652187A此專利與上述類似，只是先生成中間產(chǎn)物2,2',6,6'-偶氮四甲基苯胺-N,N-二氧化物，然后用硫代硫酸鈉和硫氫化鈉還原為2,2',6,6'-四甲基二苯肼，再用酸重排得到3,3',5,5'-四甲基聯(lián)苯胺鹽酸鹽。

以上合成方法，有的用到鈀碳等成本較高，有的步驟繁瑣或收率太低，或僅限于小試研究，不適于工業(yè)化放大生產(chǎn)。

制備方法

步驟1：2,2',6,6'-四甲基偶氮苯的合成

在2000mL三頸玻璃瓶中，加入2,6-二甲基苯胺121克(1mol)，以及1000mL乙酸乙酯，攪拌，再加入高錳酸鉀237克(1.5mol)，于室溫下攪拌反應(yīng)24小時，反應(yīng)完畢，抽濾，濾餅用乙酸乙酯洗滌，合并濾液，濃縮得到2,2',6,6'-四甲基偶氮苯114克，收率95.8%，可直接進(jìn)行下一步反應(yīng)。

步驟2：3,3',5,5'-四甲基聯(lián)苯胺的合成

在2000mL三頸玻璃瓶中，把2,2',6,6'-四甲基偶氮苯95.2克(0.4mol)溶于800mL乙酸乙酯中，溶液呈現(xiàn)深棕紅色，加入6M鹽酸200mL(1.2mol)和鋅粉52克(0.8mol)，室溫下攪拌進(jìn)行反應(yīng)，反應(yīng)體系先由原來的棕色逐漸由深變淺，后變?yōu)闊o色澄清，然后又有白色固體產(chǎn)生，待反應(yīng)完畢，加入氫氧化鈉水溶液，調(diào)到中性至堿性，分層，有機層水洗，無水硫酸鈉干燥，有機層濃縮后，正庚烷打漿得到白色晶狀固體3,3',5,5'-四甲基聯(lián)苯胺92克，熔點：169-170°C，收率96%。

步驟3：3,3',5,5'-四甲基聯(lián)苯胺鹽酸鹽的合成

在2000mL三頸玻璃瓶中，加入3,3',5,5'-四甲基聯(lián)苯胺120克(0.5mol)和1000mL乙酸乙酯，攪拌，使完全溶解為澄清透明溶液，緩慢加入30%濃鹽酸，有固體生成，待加入30%鹽酸120mL后，再攪拌30分鐘，然后抽濾，得到白色固體，用水重結(jié)晶，得到白色晶狀固體3,3',5,5'-四甲基聯(lián)苯胺鹽酸鹽133克，收率85%。

參考文獻(xiàn)

[1]南京艾普特生物醫(yī)藥有限公司. 一種3,3’,5,5’-四甲基聯(lián)苯胺及其鹽酸鹽的合成方法:CN201810765630.6[P]. 2020-11-10.