背景^[1-3]

人補(bǔ)體片斷5a(C5a)Elisa試劑盒是用于檢測樣本中補(bǔ)體成分5a（C5a）含量的一種實(shí)驗(yàn)工具，廣泛應(yīng)用于科研領(lǐng)域。C5a是補(bǔ)體系統(tǒng)的一種重要成分，具有高度的炎癥性和趨化性。它參與多種生理和病理過程，如炎癥反應(yīng)、免疫調(diào)節(jié)、細(xì)胞凋亡等。因此，檢測樣本中的C5a含量對于研究這些過程具有重要意義。以下是關(guān)于人補(bǔ)體片斷5a(C5a)Elisa試劑盒的詳細(xì)介紹：

人補(bǔ)體片斷5a(C5a)Elisa試劑盒

一、基本信息

產(chǎn)品名稱：人補(bǔ)體片斷5a(C5a)Elisa試劑盒

英文名稱：Human Complement Fragment 5a(C5a)ELISA Kit

用途：僅供科研使用，用于定性或定量分析樣本中的C5a含量

樣本類型：包括血清、血漿、組織勻漿、細(xì)胞培養(yǎng)上清液等

檢測原理：通常采用雙抗體夾心法酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)（ELISA），通過抗原抗體反應(yīng)和酶促反應(yīng)，檢測樣本中的C5a含量

二、產(chǎn)品規(guī)格與價(jià)格

規(guī)格：常見的有48T和96T兩種規(guī)格，具體取決于不同品牌和生產(chǎn)商

價(jià)格：價(jià)格因品牌、規(guī)格和市場供應(yīng)情況而異，例如某些品牌的96T規(guī)格試劑盒價(jià)格約為1750元/盒起，具體價(jià)格需向供應(yīng)商咨詢

三、保存與使用

保存條件：通常需保存在2-8℃的低溫環(huán)境中，避免陽光直射和潮濕

使用前準(zhǔn)備：使用前需將試劑盒置于室溫平衡一段時(shí)間（如20分鐘），確保試劑溫度與室溫一致

操作步驟：按照試劑盒說明書進(jìn)行操作，包括樣本處理、加樣、溫育、洗滌、顯色和測定等步驟

四、注意事項(xiàng)

操作規(guī)范：嚴(yán)格遵守實(shí)驗(yàn)室操作規(guī)范，避免交叉污染和假陽性/假陰性結(jié)果

樣本處理：不同樣本類型的處理方法可能有所不同，需按照說明書要求進(jìn)行處理

結(jié)果分析：根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算樣本中C5a的含量，注意結(jié)果的準(zhǔn)確性和可重復(fù)性

五、操作步驟

實(shí)驗(yàn)開始前，各試劑均應(yīng)平衡至室溫（試劑不能直接在37℃溶解）；試劑或樣品稀釋時(shí)，均需混勻，混勻時(shí)盡量避免起泡。實(shí)驗(yàn)前應(yīng)預(yù)測樣品含量，如樣品濃度過高時(shí)，應(yīng)對樣品進(jìn)行稀釋，以使稀釋后的樣品符合試劑盒的檢測范圍，計(jì)算時(shí)再乘以相應(yīng)的稀釋倍數(shù)。

1.加樣：分別設(shè)空白孔、標(biāo)準(zhǔn)孔、待測樣品孔。空白孔加樣品稀釋液100μl，余孔分別加標(biāo)準(zhǔn)品或待測樣品100μl，注意不要有氣泡，加樣將樣品加于酶標(biāo)板孔底部，盡量不觸及孔壁，輕輕晃動(dòng)混勻，酶標(biāo)板加上蓋或覆膜，37℃反應(yīng)120分鐘。為保證實(shí)驗(yàn)結(jié)果有效性，每次實(shí)驗(yàn)請使用新的標(biāo)準(zhǔn)品溶液。

2.棄去液體，甩干，不用洗滌。每孔加檢測溶液A工作液100μl（在使用前一小時(shí)內(nèi)配制），酶標(biāo)板加上覆膜,37℃反應(yīng)60分鐘。

3.溫育60分鐘后，棄去孔內(nèi)液體，甩干，洗板3次，每次浸泡1-2分鐘，大約400μl/每孔，甩干（也可輕拍將孔內(nèi)液體拍干）。

4.每孔加檢測溶液B工作液（同檢測A工作液）100μl，酶標(biāo)板加上覆膜37℃反應(yīng)60分鐘。

5.溫育60分鐘后，棄去孔內(nèi)液體，甩干，洗板5次，每次浸泡1-2分鐘，350μl/每孔，甩干（也可輕拍將孔內(nèi)液體拍干）。

6.依序每孔加底物溶液90μl，酶標(biāo)板加上覆膜37℃避光顯色（30分鐘內(nèi)，此時(shí)肉眼可見標(biāo)準(zhǔn)品的前3-4孔有明顯的梯度蘭色，后3-4孔梯度不明顯，即可終止）。

7.依序每孔加終止溶液50μl，終止反應(yīng)，此時(shí)藍(lán)色立轉(zhuǎn)黃色。終止液的加入順序應(yīng)盡量與底物液的加入順序相同。為了保證實(shí)驗(yàn)結(jié)果的準(zhǔn)確性，底物反應(yīng)時(shí)間到后應(yīng)盡快加入終止液。

8.用酶聯(lián)儀在450nm波長依序測量各孔的光密度（OD值）。在加終止液后立即進(jìn)行檢測。

應(yīng)用^[4][5]

人補(bǔ)體片斷5a(C5a)Elisa試劑盒可以用于斑馬魚補(bǔ)體C5a/C5aR1的克隆及在細(xì)菌性炎癥中的表達(dá)分析與功能研究

研究以斑馬魚為研究對象,通過感染不同濃度的嗜水氣單胞菌(Aeromonas hydrophila),評估感染后斑馬魚的生存與組織損傷情況、分析不同時(shí)間點(diǎn)補(bǔ)體C5a和受體C5a R1以及炎癥相關(guān)細(xì)胞因子在不同組織中的表達(dá)模式,闡述斑馬魚細(xì)菌感染后C5a/C5a R1通路激活與炎癥反應(yīng)的關(guān)系。此外,通過在感染前對斑馬魚進(jìn)行C5a R1拮抗劑(W-54011)預(yù)處理,探究其對斑馬魚細(xì)菌感染后炎癥反應(yīng)的影響,進(jìn)一步探討了補(bǔ)體C5a/C5a R1通路在斑馬魚應(yīng)對病原菌感染的炎癥反應(yīng)進(jìn)程中發(fā)揮的作用。

本文主要的研究結(jié)果如下:(1)通過克隆得到斑馬魚C5a和C5a R1的CDS序列,序列長度分別為228 bp和1041 bp,分別編碼76和346個(gè)氨基酸。系統(tǒng)發(fā)育進(jìn)化樹顯示斑馬魚C5a R1首先與其他鯉科魚類聚合,其中草魚(Ctenopharyngodon idella)與斑馬魚的親緣關(guān)系最為密切,相似度為78.9%。實(shí)時(shí)熒光定量PCR(quantitative real-time PCR,q RT-PCR)和人補(bǔ)體片斷5a(C5a)Elisa試劑盒檢測結(jié)果顯示,C5a和C5a R1在健康斑馬魚的肝、腸、脾、腦、鰓、皮膚、肌肉、心臟、眼睛、尾鰭、性腺11種組織中均有分布,其中C5a在肝臟中表達(dá)最高,C5a R1在脾臟中表達(dá)最高。(2)斑馬魚的存活率和組織損傷程度與細(xì)菌感染濃度密切相關(guān)。嗜水氣單胞菌感染濃度為6.8×10～5、6.3×10～6、1.0×10～7、2.0×10～7、3.4×10～7、5.3×10～7和1.0×10～8CFU/m L時(shí),斑馬魚存活率分別為100%、80%、63.3%、46.7%、16.7%、0和0。根據(jù)此結(jié)果選取3.0×10～7和1.0×10～7CFU/m L分別作為后續(xù)實(shí)驗(yàn)中處理組1(treatment group 1,TG1)和處理組2(treatment group 2,TG2)的感染濃度。對照組(control group,CG)存活率為100%,TG2的存活率為59.6%,顯著高于TG1(23.3%)。組織病理切片顯示,斑馬魚的腸損傷主要表現(xiàn)為黏膜層和黏膜固有層組織分離、小腸絨毛斷裂和杯狀細(xì)胞大量增多。感染后24 h時(shí)病理損傷最嚴(yán)重,48 h時(shí)開始有所減輕。相比之下,TG1的損傷程度較TG2更為嚴(yán)重,且恢復(fù)較慢。(3)嚴(yán)重的細(xì)菌感染導(dǎo)致C5a/C5a R1通路過度激活,且激活程度與細(xì)菌感染呈現(xiàn)劑量關(guān)系。q RT-PCR及人補(bǔ)體片斷5a(C5a)Elisa試劑盒檢測結(jié)果發(fā)現(xiàn),嗜水氣單胞菌感染后,與CG相比,TG1和TG2的肝、腸、脾、鰓中C5a、C5a R1的表達(dá)量顯著上升,且兩個(gè)基因的表達(dá)模式相同,主要表現(xiàn)為:在感染后72 h內(nèi),C5a和C5a R1在不同組織中的表達(dá)量均呈現(xiàn)先上升后下降的趨勢。TG1中,C5a和C5a R1在感染后12 h或24 h時(shí)相對表達(dá)量達(dá)到最高,而TG2中在感染后24 h或48 h時(shí)相對表達(dá)量達(dá)到最高。此外,C5a和C5a R1在TG1四種組織中的相對表達(dá)水平均高于TG2。

參考文獻(xiàn)

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