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人補(bǔ)體片斷5a(C5a)Elisa試劑盒的應(yīng)用

2024/9/2 8:43:15 作者:云霄

背景[1-3]

人補(bǔ)體片斷5a(C5a)Elisa試劑盒是用于檢測樣本中補(bǔ)體成分5a(C5a)含量的一種實(shí)驗(yàn)工具,廣泛應(yīng)用于科研領(lǐng)域。C5a是補(bǔ)體系統(tǒng)的一種重要成分,具有高度的炎癥性和趨化性。它參與多種生理和病理過程,如炎癥反應(yīng)、免疫調(diào)節(jié)、細(xì)胞凋亡等。因此,檢測樣本中的C5a含量對于研究這些過程具有重要意義。以下是關(guān)于人補(bǔ)體片斷5a(C5a)Elisa試劑盒的詳細(xì)介紹:

人補(bǔ)體片斷5a(C5a)Elisa試劑盒.png

人補(bǔ)體片斷5a(C5a)Elisa試劑盒

一、基本信息

產(chǎn)品名稱:人補(bǔ)體片斷5a(C5a)Elisa試劑盒

英文名稱:Human Complement Fragment 5a(C5a)ELISA Kit

用途:僅供科研使用,用于定性或定量分析樣本中的C5a含量

樣本類型:包括血清、血漿、組織勻漿、細(xì)胞培養(yǎng)上清液等

檢測原理:通常采用雙抗體夾心法酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)(ELISA),通過抗原抗體反應(yīng)和酶促反應(yīng),檢測樣本中的C5a含量

二、產(chǎn)品規(guī)格與價(jià)格

規(guī)格:常見的有48T和96T兩種規(guī)格,具體取決于不同品牌和生產(chǎn)商

價(jià)格:價(jià)格因品牌、規(guī)格和市場供應(yīng)情況而異,例如某些品牌的96T規(guī)格試劑盒價(jià)格約為1750元/盒起,具體價(jià)格需向供應(yīng)商咨詢

三、保存與使用

保存條件:通常需保存在2-8℃的低溫環(huán)境中,避免陽光直射和潮濕

使用前準(zhǔn)備:使用前需將試劑盒置于室溫平衡一段時(shí)間(如20分鐘),確保試劑溫度與室溫一致

操作步驟:按照試劑盒說明書進(jìn)行操作,包括樣本處理、加樣、溫育、洗滌、顯色和測定等步驟

四、注意事項(xiàng)

操作規(guī)范:嚴(yán)格遵守實(shí)驗(yàn)室操作規(guī)范,避免交叉污染和假陽性/假陰性結(jié)果

樣本處理:不同樣本類型的處理方法可能有所不同,需按照說明書要求進(jìn)行處理

結(jié)果分析:根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算樣本中C5a的含量,注意結(jié)果的準(zhǔn)確性和可重復(fù)性

五、操作步驟

實(shí)驗(yàn)開始前,各試劑均應(yīng)平衡至室溫(試劑不能直接在37℃溶解);試劑或樣品稀釋時(shí),均需混勻,混勻時(shí)盡量避免起泡。實(shí)驗(yàn)前應(yīng)預(yù)測樣品含量,如樣品濃度過高時(shí),應(yīng)對樣品進(jìn)行稀釋,以使稀釋后的樣品符合試劑盒的檢測范圍,計(jì)算時(shí)再乘以相應(yīng)的稀釋倍數(shù)。

1.加樣:分別設(shè)空白孔、標(biāo)準(zhǔn)孔、待測樣品孔。空白孔加樣品稀釋液100μl,余孔分別加標(biāo)準(zhǔn)品或待測樣品100μl,注意不要有氣泡,加樣將樣品加于酶標(biāo)板孔底部,盡量不觸及孔壁,輕輕晃動(dòng)混勻,酶標(biāo)板加上蓋或覆膜,37℃反應(yīng)120分鐘。為保證實(shí)驗(yàn)結(jié)果有效性,每次實(shí)驗(yàn)請使用新的標(biāo)準(zhǔn)品溶液。

2.棄去液體,甩干,不用洗滌。每孔加檢測溶液A工作液100μl(在使用前一小時(shí)內(nèi)配制),酶標(biāo)板加上覆膜,37℃反應(yīng)60分鐘。

3.溫育60分鐘后,棄去孔內(nèi)液體,甩干,洗板3次,每次浸泡1-2分鐘,大約400μl/每孔,甩干(也可輕拍將孔內(nèi)液體拍干)。

4.每孔加檢測溶液B工作液(同檢測A工作液)100μl,酶標(biāo)板加上覆膜37℃反應(yīng)60分鐘。

5.溫育60分鐘后,棄去孔內(nèi)液體,甩干,洗板5次,每次浸泡1-2分鐘,350μl/每孔,甩干(也可輕拍將孔內(nèi)液體拍干)。

6.依序每孔加底物溶液90μl,酶標(biāo)板加上覆膜37℃避光顯色(30分鐘內(nèi),此時(shí)肉眼可見標(biāo)準(zhǔn)品的前3-4孔有明顯的梯度蘭色,后3-4孔梯度不明顯,即可終止)。

7.依序每孔加終止溶液50μl,終止反應(yīng),此時(shí)藍(lán)色立轉(zhuǎn)黃色。終止液的加入順序應(yīng)盡量與底物液的加入順序相同。為了保證實(shí)驗(yàn)結(jié)果的準(zhǔn)確性,底物反應(yīng)時(shí)間到后應(yīng)盡快加入終止液。

8.用酶聯(lián)儀在450nm波長依序測量各孔的光密度(OD值)。在加終止液后立即進(jìn)行檢測。

應(yīng)用[4][5]

人補(bǔ)體片斷5a(C5a)Elisa試劑盒可以用于斑馬魚補(bǔ)體C5a/C5aR1的克隆及在細(xì)菌性炎癥中的表達(dá)分析與功能研究

研究以斑馬魚為研究對象,通過感染不同濃度的嗜水氣單胞菌(Aeromonas hydrophila),評估感染后斑馬魚的生存與組織損傷情況、分析不同時(shí)間點(diǎn)補(bǔ)體C5a和受體C5a R1以及炎癥相關(guān)細(xì)胞因子在不同組織中的表達(dá)模式,闡述斑馬魚細(xì)菌感染后C5a/C5a R1通路激活與炎癥反應(yīng)的關(guān)系。此外,通過在感染前對斑馬魚進(jìn)行C5a R1拮抗劑(W-54011)預(yù)處理,探究其對斑馬魚細(xì)菌感染后炎癥反應(yīng)的影響,進(jìn)一步探討了補(bǔ)體C5a/C5a R1通路在斑馬魚應(yīng)對病原菌感染的炎癥反應(yīng)進(jìn)程中發(fā)揮的作用。

本文主要的研究結(jié)果如下:(1)通過克隆得到斑馬魚C5a和C5a R1的CDS序列,序列長度分別為228 bp和1041 bp,分別編碼76和346個(gè)氨基酸。系統(tǒng)發(fā)育進(jìn)化樹顯示斑馬魚C5a R1首先與其他鯉科魚類聚合,其中草魚(Ctenopharyngodon idella)與斑馬魚的親緣關(guān)系最為密切,相似度為78.9%。實(shí)時(shí)熒光定量PCR(quantitative real-time PCR,q RT-PCR)和人補(bǔ)體片斷5a(C5a)Elisa試劑盒檢測結(jié)果顯示,C5a和C5a R1在健康斑馬魚的肝、腸、脾、腦、鰓、皮膚、肌肉、心臟、眼睛、尾鰭、性腺11種組織中均有分布,其中C5a在肝臟中表達(dá)最高,C5a R1在脾臟中表達(dá)最高。(2)斑馬魚的存活率和組織損傷程度與細(xì)菌感染濃度密切相關(guān)。嗜水氣單胞菌感染濃度為6.8×10~5、6.3×10~6、1.0×10~7、2.0×10~7、3.4×10~7、5.3×10~7和1.0×10~8CFU/m L時(shí),斑馬魚存活率分別為100%、80%、63.3%、46.7%、16.7%、0和0。根據(jù)此結(jié)果選取3.0×10~7和1.0×10~7CFU/m L分別作為后續(xù)實(shí)驗(yàn)中處理組1(treatment group 1,TG1)和處理組2(treatment group 2,TG2)的感染濃度。對照組(control group,CG)存活率為100%,TG2的存活率為59.6%,顯著高于TG1(23.3%)。組織病理切片顯示,斑馬魚的腸損傷主要表現(xiàn)為黏膜層和黏膜固有層組織分離、小腸絨毛斷裂和杯狀細(xì)胞大量增多。感染后24 h時(shí)病理損傷最嚴(yán)重,48 h時(shí)開始有所減輕。相比之下,TG1的損傷程度較TG2更為嚴(yán)重,且恢復(fù)較慢。(3)嚴(yán)重的細(xì)菌感染導(dǎo)致C5a/C5a R1通路過度激活,且激活程度與細(xì)菌感染呈現(xiàn)劑量關(guān)系。q RT-PCR及人補(bǔ)體片斷5a(C5a)Elisa試劑盒檢測結(jié)果發(fā)現(xiàn),嗜水氣單胞菌感染后,與CG相比,TG1和TG2的肝、腸、脾、鰓中C5a、C5a R1的表達(dá)量顯著上升,且兩個(gè)基因的表達(dá)模式相同,主要表現(xiàn)為:在感染后72 h內(nèi),C5a和C5a R1在不同組織中的表達(dá)量均呈現(xiàn)先上升后下降的趨勢。TG1中,C5a和C5a R1在感染后12 h或24 h時(shí)相對表達(dá)量達(dá)到最高,而TG2中在感染后24 h或48 h時(shí)相對表達(dá)量達(dá)到最高。此外,C5a和C5a R1在TG1四種組織中的相對表達(dá)水平均高于TG2。

參考文獻(xiàn)

[1]Transcriptome,intestinal microbiome and histomorphology profiling of differences in the response of Chinese sea bass(Lateolabrax maculatus)to Aeromonas hydrophila infection[J].Pan Chao;Zhu Yanran;Cao Kaixin;Li Juexian;Wang Siyu;Zhu Jiahua;Zeng Xiaoman;Zhang Heqian;Qin Zhiwei.Frontiers in Microbiology,2023

[2]Intracellular complement C5a/C5aR1 stabilizesβ-catenin to promote colorectal tumorigenesis.[J].Ding Peipei;Xu Yanqing;Li Luying;Lv Xinyue;Li Ling;Chen Jianfeng;Zhou Danlei;Wang Xiaochao;Wang Qi;Zhang Wei;Liao Tian;Ji QingHai;Lei QunYing;Hu Weiguo.Cell reports,2022

[3]Immunosuppression participated in complement activation-mediated inflammatory injury caused by 4-octylphenol via TLR7/IκBα/NF-κB pathway in common carp(Cyprinus carpio)gills.[J].Sun Qi;Liu Yuhao;Teng Xiaojie;Luan Peng;Teng Xiaohua;Yin Xiujie.Aquatic toxicology(Amsterdam,Netherlands),2022

[4]The intestinal histopathology,innate immune response and antioxidant capacity of blunt snout bream(Megalobrama amblycephala)in response to Aeromonas hydrophila.[J].Zhang Chunnuan;Yuan Xiaoyu;Xu Ruiyi;Qi Qian;Wang Yang.Fish&shellfish immunology,2022

[5]劉鑫寶.斑馬魚補(bǔ)體C5a/C5aR1的克隆及在細(xì)菌性炎癥中的表達(dá)分析與功能研究[D].青島大學(xué),2023.

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