背景[1-7]
細(xì)胞凋亡檢測(cè)服務(wù)對(duì)胚胎發(fā)育及形態(tài)發(fā)生、組織內(nèi)正常細(xì)胞群的穩(wěn)定、機(jī)體的防御和免疫反應(yīng)、疾病或中毒時(shí)引起的細(xì)胞損傷、老化、腫瘤的發(fā)生進(jìn)展起著重要作用，并具有潛在的治療意義，一直是生物醫(yī)學(xué)研究的熱點(diǎn)。細(xì)胞凋亡（Apoptosis）是指為維持內(nèi)環(huán)境穩(wěn)定，由基因控制的細(xì)胞自主的有序的死亡。
作為細(xì)胞的一種基本生物學(xué)現(xiàn)象，細(xì)胞凋亡是機(jī)體為更好地適應(yīng)生存環(huán)境，而主動(dòng)爭(zhēng)取的一種死亡過程，它涉及一系列基因的激活、表達(dá)以及調(diào)控等的作用，一般過程包括4個(gè)階段，即：誘導(dǎo)啟動(dòng)、細(xì)胞內(nèi)調(diào)控、實(shí)施和凋亡細(xì)胞的吞噬搬運(yùn)。細(xì)胞凋亡不僅是一種特殊的細(xì)胞死亡類型，而且具有重要的生物學(xué)意義及復(fù)雜的分子生物學(xué)機(jī)制。
凋亡檢測(cè)以“PI和Annexin-V雙標(biāo)”方法為主。磷脂酰絲氨酸（Phosphatidylserine,PS）正常位于細(xì)胞膜的內(nèi)側(cè)，但在細(xì)胞凋亡的早期（或細(xì)胞損傷時(shí)），PS可從細(xì)胞膜的內(nèi)側(cè)翻轉(zhuǎn)到細(xì)胞膜的表面，暴露在細(xì)胞外環(huán)境中。Annexin V是一種Ca2+依賴的磷脂結(jié)合蛋白，具有易于結(jié)合PS的特性，可充當(dāng)敏感的探針檢測(cè)暴露在細(xì)胞膜表面的PS。
碘化丙啶（Propidine Iodide,PI）是一種核酸染料，不能透過完整的細(xì)胞膜，但能夠透過凋亡中晚期的細(xì)胞和死細(xì)胞的細(xì)胞膜，從而使細(xì)胞核染成紅色。將Annexin V和PI一起使用，可以將凋亡早期、晚期的細(xì)胞以及死細(xì)胞區(qū)分開來。細(xì)胞凋亡檢測(cè)原理：Annexin V選擇性結(jié)合磷脂酰絲氨酸(phosphatidylserine，簡(jiǎn)稱PS)。磷脂酰絲氨酸主要分布在細(xì)胞膜內(nèi)側(cè)，即與細(xì)胞漿相鄰的一側(cè)。
在細(xì)胞發(fā)生凋亡的早期，不同類型的細(xì)胞都會(huì)把磷脂酰絲氨酸外翻到細(xì)胞表面，即細(xì)胞膜外側(cè)。磷脂酰絲氨酸暴露到細(xì)胞表面后會(huì)促進(jìn)凝血和炎癥反應(yīng)。而Annexin V和外翻到細(xì)胞表面的磷脂酰絲氨酸結(jié)合后可以阻斷磷脂酰絲氨酸的促凝血和促炎癥反應(yīng)活性。碘化丙啶可以染色壞死細(xì)胞或凋亡晚期喪失細(xì)胞膜完整性的細(xì)胞，呈現(xiàn)紅色熒光。
應(yīng)用[8][9]
細(xì)胞凋亡檢測(cè)服務(wù)可用于誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞凋亡研究：
誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞凋亡（apoptosis）是現(xiàn)在治療癌癥的一種重要的方法，細(xì)胞凋亡被廣泛認(rèn)為是細(xì)胞程序性死亡的一種有特色的、重要的模式，細(xì)胞程序性死亡是基因決定的細(xì)胞減少。細(xì)胞凋亡在細(xì)胞生長(zhǎng)和衰老過程中正常發(fā)生，并且作為一種平衡機(jī)制來維持組織中細(xì)胞的數(shù)量。
細(xì)胞凋亡是通過一種多點(diǎn)緊密調(diào)節(jié)的復(fù)雜信號(hào)級(jí)聯(lián)反應(yīng)發(fā)生的，因此有很多的機(jī)會(huì)能夠評(píng)價(jià)所涉及蛋白的活性。然而，同樣重要且值得一提的是，已經(jīng)有文獻(xiàn)報(bào)道細(xì)胞程序性死亡的其它形式，而且預(yù)計(jì)將發(fā)現(xiàn)更多種其它形式。對(duì)凋亡的腫瘤細(xì)胞進(jìn)行檢測(cè)，可以判定治療效果以及預(yù)后，是癌癥治療當(dāng)中非常重要的一部分。構(gòu)建了一種基于金納米粒子非共價(jià)交聯(lián)變色的比色方法用于檢測(cè)細(xì)胞凋亡。
半胱天冬酶家族（caspases）中的caspase–3是細(xì)胞凋亡早期一種非常重要的物質(zhì)，它能特異性地識(shí)別含有天冬氨酸–谷氨酸–纈氨酸–天冬氨酸（Asp–Glu–Val–Asp，DEVD）序列氨基酸的多肽，并在碳端的天冬氨酸后選擇性地切斷多肽。
基于此，設(shè)計(jì)了一條含有DEVD的多肽序列Ac–Gly–Asp–Glu–Val–Asp–Cys–Cys–Arg–NH2（GR–8）做為caspase–3的底物，在被切斷前，GR–8加入金納米粒子溶液中時(shí)，能夠保持檸檬酸根離子包裹的金納米粒子（帶負(fù)電）的靜電穩(wěn)定性；被caspase–3切斷后，一條含有兩個(gè)巰基并帶正電的Cys–Cys–Arg–NH2（CR–3）被釋放出來，CR–3嚴(yán)重影響了金納米粒子的靜電穩(wěn)定性，從而引起金納米粒子的聚集。通過測(cè)量金納米粒子聚集前后650nm處與520nm處的紫外可見吸收比值（Abs650/Abs520），可以反映caspase–3的活性，而caspase–3的活性反映了細(xì)胞凋亡的情況。該方法可以用來定量檢測(cè)caspase–3活性和定性檢測(cè)細(xì)胞凋亡。
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