背景[1-7]
細胞周期檢測服務通過核酸染料PI標記DNA,并由流式細胞儀進行分析，得到細胞各個時期的分布狀態(tài)，計算出G0/G1%、S%、G2/M%，了解增殖能力，在腫瘤病理學研究中，通常以S期細胞比率作為判斷腫瘤增殖狀態(tài)的指標。細胞周期（Cell Cycle）是指細胞從一次分裂完成開始到下一次分裂結束所經歷的全過程，細胞的遺傳物質復制并均等地分配給兩個子細胞。細胞周期分為間期與分裂期兩個階段。間期又分為三期：即DNA合成前期（G1期）、DNA合成期（S期）與DNA合成后期（G2期）。某些細胞在分裂結束后暫時離開細胞周期，停止細胞分裂，執(zhí)行一定生物學功能（G0期）。
細胞周期檢測的原理：
PI法是經典的周期檢測方法。PI為插入性核酸熒光染料，能選擇性的嵌入核酸DNA和RNA雙鏈螺旋的堿基之間與之結合，其結合的量與DNA的含量成正比例關系，用流式細胞儀進行分析，就可以得到細胞周期各個階段的DNA分布狀態(tài)，從而計算出各個期的百分含量。PI染色后，假設G0/G1期細胞的熒光強度為1，那么含有雙份基因組DNA的G2/M期細胞的熒光強度的理論值為2，正在進行DNA復制的S期細胞的熒光強度為1-2之間。
細胞周期內有兩個階段為重要：G1到S和G2到M；這兩個階段正處在復雜活躍的分子水平變化的時期，容易受環(huán)境條件的影響，如果能夠人為地進行調控，將對深入了解生物的生長發(fā)育和控制腫瘤生長等有重要意義。能夠方便有效地檢測細胞周期的變化，對于藥物研發(fā)和疾病研究等都具有重要的意義。單個細胞的周期測定可采用縮時攝影的方法，但它不能代表細胞群體的周期，故現多采用其他方法測群體周期。
測定細胞周期的方法很多，有同位素標記法、流式細胞儀法、基于細胞成像的熒光檢測法等。流式細胞儀PI染色法檢測細胞周期的原理：由于細胞周期各時相的DNA含量不同,通常正常細胞的G1/G0期具有二倍體細胞的DNA含量(2N),而G2/M期具有四倍體細胞的DNA含量(4N),而S期的DNA含量介于二倍體和四倍體之間。
PI可以與DNA結合，其熒光強度直接反映了細胞內DNA含量。因此,通過流式細胞儀PI染色法對細胞內DNA含量進行檢測時,可以將細胞周期各時相區(qū)分為G1/G0期,S期和G2/M期,獲得的流式直方圖對應的各細胞周期可通過特殊軟件計算各時相的細胞百分率。
應用[8][9]
細胞周期檢測服務可用于調控細胞周期的機制研究：
在CyclinD1通過激活NDR調控細胞周期的機制研究中研究cyclinD1是否可以通過上調NDR1/2的活性來調控細胞周期的進程,制備了可誘導表達cyclinD1和cyclinD1K112E的穩(wěn)定細胞株。Cyclin/Cdk蛋白激酶作為細胞周期調控最為關鍵的分子在細胞周期調控中發(fā)揮重要的作用。不同類型的cyclin/Cdk調控著細胞周期的不同的時期。其中cyclinDl/Cdk4主要在G1期發(fā)揮作用。
通過流式細胞術實驗發(fā)現,不僅cyclinD1可以促進細胞周期G1/S期的進程,而且cyclinD1K112E也可以。這就證明cyclinD1可以通過不依賴于Cdk4的信號通路來調控細胞周期。而且還發(fā)現在正常細胞中過表達cyclinD1或cyclinD1K112E都可以促進細胞周期G1/S期的轉換。為了進一步研究cyclinD1的這種功能是否與NDR1/2有關,先用siRNA敲低NDR1/2,再用流式細胞術來分析過表達cyclinD1對細胞周期的影響。
發(fā)現敲低NDR1/2后,過表達cyclinD1K112E對細胞周期的促進作用幾乎消失。這就證明了cyclinD1可以通過調控NDR1/2的來調控細胞周期。由于NDR調控細胞周期是通過下調p21來起作用的,于是我們在穩(wěn)定細胞系中敲低p21后,流失細胞術分析發(fā)現cyclinD1K112E不再促進S期的進程。鑒于cyclinD1是通過釋放NDR的自身抑制序列來調控NDR活性的,我們在穩(wěn)定細胞系中轉染了NDR-IM,流式細胞術分析發(fā)現,過表達NDR-IM也可以抑制cyclinD1K112E的對細胞周期的促進作用。
參考文獻
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