背景^[1-7]

細(xì)胞周期檢測(cè)服務(wù)通過(guò)核酸染料PI標(biāo)記DNA,并由流式細(xì)胞儀進(jìn)行分析，得到細(xì)胞各個(gè)時(shí)期的分布狀態(tài)，計(jì)算出G0/G1%、S%、G2/M%，了解增殖能力，在腫瘤病理學(xué)研究中，通常以S期細(xì)胞比率作為判斷腫瘤增殖狀態(tài)的指標(biāo)。細(xì)胞周期（Cell Cycle）是指細(xì)胞從一次分裂完成開(kāi)始到下一次分裂結(jié)束所經(jīng)歷的全過(guò)程，細(xì)胞的遺傳物質(zhì)復(fù)制并均等地分配給兩個(gè)子細(xì)胞。細(xì)胞周期分為間期與分裂期兩個(gè)階段。間期又分為三期：即DNA合成前期（G1期）、DNA合成期（S期）與DNA合成后期（G2期）。某些細(xì)胞在分裂結(jié)束后暫時(shí)離開(kāi)細(xì)胞周期，停止細(xì)胞分裂，執(zhí)行一定生物學(xué)功能（G0期）。

細(xì)胞周期檢測(cè)的原理：

PI法是經(jīng)典的周期檢測(cè)方法。PI為插入性核酸熒光染料，能選擇性的嵌入核酸DNA和RNA雙鏈螺旋的堿基之間與之結(jié)合，其結(jié)合的量與DNA的含量成正比例關(guān)系，用流式細(xì)胞儀進(jìn)行分析，就可以得到細(xì)胞周期各個(gè)階段的DNA分布狀態(tài)，從而計(jì)算出各個(gè)期的百分含量。PI染色后，假設(shè)G0/G1期細(xì)胞的熒光強(qiáng)度為1，那么含有雙份基因組DNA的G2/M期細(xì)胞的熒光強(qiáng)度的理論值為2，正在進(jìn)行DNA復(fù)制的S期細(xì)胞的熒光強(qiáng)度為1-2之間。

細(xì)胞周期內(nèi)有兩個(gè)階段為重要：G1到S和G2到M；這兩個(gè)階段正處在復(fù)雜活躍的分子水平變化的時(shí)期，容易受環(huán)境條件的影響，如果能夠人為地進(jìn)行調(diào)控，將對(duì)深入了解生物的生長(zhǎng)發(fā)育和控制腫瘤生長(zhǎng)等有重要意義。能夠方便有效地檢測(cè)細(xì)胞周期的變化，對(duì)于藥物研發(fā)和疾病研究等都具有重要的意義。單個(gè)細(xì)胞的周期測(cè)定可采用縮時(shí)攝影的方法，但它不能代表細(xì)胞群體的周期，故現(xiàn)多采用其他方法測(cè)群體周期。

測(cè)定細(xì)胞周期的方法很多，有同位素標(biāo)記法、流式細(xì)胞儀法、基于細(xì)胞成像的熒光檢測(cè)法等。流式細(xì)胞儀PI染色法檢測(cè)細(xì)胞周期的原理：由于細(xì)胞周期各時(shí)相的DNA含量不同,通常正常細(xì)胞的G1/G0期具有二倍體細(xì)胞的DNA含量(2N),而G2/M期具有四倍體細(xì)胞的DNA含量(4N),而S期的DNA含量介于二倍體和四倍體之間。

PI可以與DNA結(jié)合，其熒光強(qiáng)度直接反映了細(xì)胞內(nèi)DNA含量。因此,通過(guò)流式細(xì)胞儀PI染色法對(duì)細(xì)胞內(nèi)DNA含量進(jìn)行檢測(cè)時(shí),可以將細(xì)胞周期各時(shí)相區(qū)分為G1/G0期,S期和G2/M期,獲得的流式直方圖對(duì)應(yīng)的各細(xì)胞周期可通過(guò)特殊軟件計(jì)算各時(shí)相的細(xì)胞百分率。

應(yīng)用^[8][9]

細(xì)胞周期檢測(cè)服務(wù)可用于調(diào)控細(xì)胞周期的機(jī)制研究：

在CyclinD1通過(guò)激活NDR調(diào)控細(xì)胞周期的機(jī)制研究中研究cyclinD1是否可以通過(guò)上調(diào)NDR1/2的活性來(lái)調(diào)控細(xì)胞周期的進(jìn)程,制備了可誘導(dǎo)表達(dá)cyclinD1和cyclinD1K112E的穩(wěn)定細(xì)胞株。Cyclin/Cdk蛋白激酶作為細(xì)胞周期調(diào)控最為關(guān)鍵的分子在細(xì)胞周期調(diào)控中發(fā)揮重要的作用。不同類型的cyclin/Cdk調(diào)控著細(xì)胞周期的不同的時(shí)期。其中cyclinDl/Cdk4主要在G1期發(fā)揮作用。

通過(guò)流式細(xì)胞術(shù)實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn),不僅cyclinD1可以促進(jìn)細(xì)胞周期G1/S期的進(jìn)程,而且cyclinD1K112E也可以。這就證明cyclinD1可以通過(guò)不依賴于Cdk4的信號(hào)通路來(lái)調(diào)控細(xì)胞周期。而且還發(fā)現(xiàn)在正常細(xì)胞中過(guò)表達(dá)cyclinD1或cyclinD1K112E都可以促進(jìn)細(xì)胞周期G1/S期的轉(zhuǎn)換。為了進(jìn)一步研究cyclinD1的這種功能是否與NDR1/2有關(guān),先用siRNA敲低NDR1/2,再用流式細(xì)胞術(shù)來(lái)分析過(guò)表達(dá)cyclinD1對(duì)細(xì)胞周期的影響。

發(fā)現(xiàn)敲低NDR1/2后,過(guò)表達(dá)cyclinD1K112E對(duì)細(xì)胞周期的促進(jìn)作用幾乎消失。這就證明了cyclinD1可以通過(guò)調(diào)控NDR1/2的來(lái)調(diào)控細(xì)胞周期。由于NDR調(diào)控細(xì)胞周期是通過(guò)下調(diào)p21來(lái)起作用的,于是我們?cè)诜€(wěn)定細(xì)胞系中敲低p21后,流失細(xì)胞術(shù)分析發(fā)現(xiàn)cyclinD1K112E不再促進(jìn)S期的進(jìn)程。鑒于cyclinD1是通過(guò)釋放NDR的自身抑制序列來(lái)調(diào)控NDR活性的,我們?cè)诜€(wěn)定細(xì)胞系中轉(zhuǎn)染了NDR-IM,流式細(xì)胞術(shù)分析發(fā)現(xiàn),過(guò)表達(dá)NDR-IM也可以抑制cyclinD1K112E的對(duì)細(xì)胞周期的促進(jìn)作用。

參考文獻(xiàn)

[1]Elevated cyclin D 1 expression is governed by plasma IGF‐1 through R as/R af/MEK/ERK pathway in rumen epithelium of goats supplying a high metabolizable energy diet[J].J.Lu,H.Zhao,J.Xu,L.Zhang,L.Yan,Z.Shen.J Anim Physiol Anim Nutr.2013(6)

[2]Inhibition of DNA binding of MCM2-7 complex by phosphorylation with cyclin-dependent kinases[J].Mariko Moritani,Yukio Ishimi.Journal of Biochemistry.2013(4)

[3]Regulation of a Novel Androgen Receptor Target Gene,the Cyclin B1 Gene,through Androgen-Dependent E2F Family Member Switching[J].Yirong Li,David Y.Zhang,Qinghu Ren,Fei Ye,Xin Zhao,Garrett Daniels,Xinyu Wu,Brian Dynlacht,Peng Lee.Molecular and Cellular Biology.2012(13)

[4]MST2-and Furry-Mediated Activation of NDR1 Kinase Is Critical for Precise Alignment of Mitotic Chromosomes[J].Shuhei Chiba,Masanori Ikeda,Kokichi Katsunuma,Kazumasa Ohashi,Kensaku Mizuno.Current Biology.2009(8)

[5]NDR Kinase Is Activated by RASSF1A/MST1 in Response to Fas Receptor Stimulation and Promotes Apoptosis[J].Anton Vichalkovski,Ekaterina Gresko,Hauke Cornils,Alexander Hergovich,Debora Schmitz,Brian A.Hemmings.Current Biology.2008(23)

[6]Temporal Organization of the Cell Cycle[J].John J.Tyson,Bela Novak.Current Biology.2008(17)

[7]Securin and not CDK1/cyclin B1 regulates sister chromatid disjunction during meiosis II in mouse eggs[J].Ibtissem Nabti,Alexandra Reis,Mark Levasseur,Olaf Stemmann,Keith T.Jones.Developmental Biology.2008(2)

[8]Centrosome-Associated NDR Kinase Regulates Centrosome Duplication[J].Alexander Hergovich,Stefan Lamla,Erich A.Nigg,Brian A.Hemmings.Molecular Cell.2007(4)

[9]杜朝陽(yáng). CyclinD1通過(guò)激活NDR調(diào)控細(xì)胞周期的機(jī)制研究[D].中國(guó)科學(xué)技術(shù)大學(xué),2013.