背景^[1-7]

細(xì)胞增殖與活性檢測服務(wù)是直接測定DNA的合成，同時也是測定物質(zhì)毒性、評估藥物安全、細(xì)胞健康的基本方法。通過檢測細(xì)胞增殖活性，可以指示腫瘤細(xì)胞增殖活性、目的基因瞬轉(zhuǎn)/穩(wěn)轉(zhuǎn)細(xì)胞系的細(xì)胞增殖活性，在小分子化合物/多肽等藥物篩選及功能安全性研究、中藥/中間體等藥物篩選及功能安全性研究、目的基因過表達(dá)的基因功能研究、目的基因RNAi干擾的基因功能研究中發(fā)揮重要作用。細(xì)胞增殖是生物體的重要生命特征，細(xì)胞以分裂的方式進(jìn)行增殖，通過分裂，可以將復(fù)制的遺傳物質(zhì)，平均地分配到兩個子細(xì)胞中去，是生物體生長、發(fā)育、繁殖和遺傳的基礎(chǔ)。

單細(xì)胞生物，以細(xì)胞分裂的方式產(chǎn)生新的個體。多細(xì)胞生物，以細(xì)胞分裂的方式產(chǎn)生新的細(xì)胞，用來補(bǔ)充體內(nèi)衰老和死亡的細(xì)胞；同時，多細(xì)胞生物可以由一個受精卵，經(jīng)過細(xì)胞的分裂和分化，最終發(fā)育成一個新的多細(xì)胞個體。目前常用的細(xì)胞增殖檢測方法包括胸腺嘧啶核苷（3H-TdR）滲入法、MTT檢測法、CFSE檢測法、Brdu檢測法、EdU檢測法以及CCK8檢測法。細(xì)胞增殖檢測方法細(xì)胞增殖檢測通常是檢測分裂中的細(xì)胞數(shù)量或者細(xì)胞群體發(fā)生的變化。

目前細(xì)胞增殖檢測主要分為五類：DNA合成檢測、代謝活性檢測、細(xì)胞數(shù)量檢測、細(xì)胞增殖相關(guān)抗原檢測和ATP濃度檢測。在這些方法中作何選擇，主要取決于所研究的細(xì)胞類型和研究方案。DNA合成檢測這是目前實(shí)驗(yàn)室中檢測細(xì)胞增殖最準(zhǔn)確可靠的方式。該法是將放射性標(biāo)記的3H-胸腺嘧啶與細(xì)胞一同孵育，這樣新增殖細(xì)胞的DNA中就會摻入放射性標(biāo)記，經(jīng)洗脫后可用閃爍計(jì)數(shù)器檢測。

該方法耗時長，而且有個明顯的弊端就，即使用和處理放射性物質(zhì)既麻煩又不安全。不過，可以使用5-溴-2-脫氧尿苷BrdU來進(jìn)行類似實(shí)驗(yàn)，因?yàn)锽rdU也同樣可以摻入到新合成的DNA中。但這樣就需要進(jìn)行額外的實(shí)驗(yàn)步驟，先孵育特異性BrdU單抗和帶標(biāo)記的二抗，然后再進(jìn)行比色法、化學(xué)發(fā)光檢測或熒光信號檢測等步驟。該方法的優(yōu)點(diǎn)就是不再需要放射性物質(zhì)。

BrdU標(biāo)記很適合免疫組化IHC、免疫細(xì)胞化學(xué)IC、細(xì)胞內(nèi)ELISA、流式細(xì)胞分析和高通量篩選。代謝活性檢測檢測細(xì)胞群體的代謝活性也可以反映細(xì)胞增殖的情況。在細(xì)胞增殖過程中脫氫酶的活性會增加，因此其底物四唑鹽或Alamar Blue在代謝活躍的細(xì)胞環(huán)境中會逐漸減少，形成能夠改變培養(yǎng)基顏色的甲臜染料?？梢酝ㄟ^低配置或高配置的分光光度計(jì)和酶標(biāo)儀來讀取含染料培養(yǎng)基的吸光度，從而衡量細(xì)胞的代謝活性，檢測細(xì)胞增殖的情況。

四種最常見的四唑鹽是：MTT、XTT、MTS和WST1。MTT在標(biāo)準(zhǔn)的細(xì)胞培養(yǎng)基中是不溶的，而且其生成的甲臜晶體需要溶解在DMSO或者異丙醇中。因此，MTT主要作為終點(diǎn)檢測方法。其他三種鹽與Alamar Blue一樣，都是可溶且無毒。它們可以作為連續(xù)監(jiān)控手段來跟蹤細(xì)胞增殖的動態(tài)改變。其中XTT的效率較低，需要添加額外的因子；WST1更靈敏有效，與其他鹽相比能夠更快顯色；Alamar Blue的靈敏度也很高，只要微孔板的孔中有100個細(xì)胞就能夠檢測到。四唑鹽和Alamar Blue氧化還原染料能夠用于多種儀器和高通量研究，非常方便。它們適用的檢測儀器包括：標(biāo)準(zhǔn)分光光度計(jì)、熒光分光光度計(jì)和酶標(biāo)儀等。

應(yīng)用^[8][9]

細(xì)胞增殖與活性檢測服務(wù)可用于藥物的細(xì)胞增值及活性檢測：

在miR-29b在慢性粒細(xì)胞白血病細(xì)胞增殖及凋亡中的作用及其機(jī)制研究中miR-29b在慢性粒細(xì)胞白血病中的表達(dá)及臨床意義慢性粒細(xì)胞白血病(Chronic myelogenous leukemia,CML)是一類起源于造血干細(xì)胞的疾病，該病的特征是9號染色體和22號染色體易位形成的bcr/abl融合基因，該基因編碼的融合蛋白具有持續(xù)激活的酪氨酸激酶活性。

Imatinib作為代BCR/ABL酪氨酸激酶抑制劑在CML的治療中已經(jīng)取得了很大的成功，該小分子抑制劑治療效果好，毒性相對較低。但是，臨床上對該藥物的耐藥越來越明顯。采用慢性粒細(xì)胞白血病急變細(xì)胞株K562細(xì)胞為研究對象，轉(zhuǎn)染miR-29b模擬物上調(diào)K562細(xì)胞中miR-29b表達(dá)，分析了miR-29b對該細(xì)胞增殖、克隆形成能力、細(xì)胞周期及細(xì)胞凋亡的影響。

MTT的結(jié)果顯示經(jīng)miR-29b處理后的K562細(xì)胞增殖減慢；克隆形成實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，與轉(zhuǎn)染NC或者未轉(zhuǎn)染的K562細(xì)胞相比，miR-29b顯著降低了K562細(xì)胞的克隆形成能力；流式細(xì)胞術(shù)分析細(xì)胞周期結(jié)果顯示miR-29b使K562細(xì)胞周期阻滯于G1期，定量PCR和Western blot的結(jié)果進(jìn)一步證實(shí)miR-29b主要是通過上調(diào)p21和p27基因和蛋白水平而使細(xì)胞周期受阻；瑞氏染色可見miR-29b處理后的K562細(xì)胞出現(xiàn)明顯的凋亡樣改變，流式細(xì)胞術(shù)分析細(xì)胞凋亡顯示早期和晚期凋亡細(xì)胞百分?jǐn)?shù)增多。

Western blot結(jié)果顯示miR-29b主要是通過活化caspase3及其底物來誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡，而且也檢測到促凋亡蛋白BAX的上調(diào)和抗凋亡蛋白BCL-2的下調(diào)。這些結(jié)果提示，miR-29b能負(fù)向調(diào)控K562細(xì)胞的增殖并促進(jìn)其凋亡。第三部分miR-29b調(diào)控慢粒細(xì)胞增殖及凋亡的機(jī)制研究我們在第二部分中已經(jīng)證明miR-29b能參與調(diào)控K562細(xì)胞增殖和凋亡。

參考文獻(xiàn)

[1]Differentially expressed miRNAs in cytogenetic and molecular subtypes of pediatric acute myeloid leukemia[J].Astrid A.Danen‐van Oorschot,Jenny E.Kuipers,SusanArentsen‐Peters,DianaSchotte,Valeriede Haas,JanTrka,AndréBaruchel,DirkReinhardt,RobPieters,C.Michel Zwaan,Marry M.van den Heuvel‐Eibrink.Pediatr.Blood Cancer.2012(5)

[2]MicroRNA-451 in chronic myeloid leukemia:miR-451–BCR-ABL regulatory loop?[J].Leukemia Research.2011(7)

[3]Posttranscriptional Regulation of MicroRNA Biogenesis in Animals[J].Haruhiko Siomi,Mikiko C.Siomi.Molecular Cell.2010(3)

[4]Expression profiling of microRNA using real-time quantitative PCR,how to use it and what is available[J].Vladimir Benes,Mirco Castoldi.Methods.2010(4)

[5]Transcriptional Control of Gene Expression by MicroRNAs[J].Basel Khraiwesh,M.Asif Arif,Gotelinde I.Seumel,Stephan Ossowski,Detlef Weigel,Ralf Reski,Wolfgang Frank.Cell.2010(1)

[6]MicroRNAs:From Decay to Decoy[J].Michaela Beitzinger,Gunter Meister.Cell.2010(5)

[7]MicroRNA-21(miR-21)represses tumor suppressor PTEN and promotes growth and invasion in non-small cell lung cancer(NSCLC)[J].Ji-guang Zhang,Jian-jun Wang,Feng Zhao,Quan Liu,Ke Jiang,Guang-hai Yang.Clinica Chimica Acta.2010(11)

[8]Mechanisms of miRNA-mediated post-transcriptional regulation in animal cells[J].Marina Chekulaeva,Witold Filipowicz.Current Opinion in Cell Biology.2009(3)

[9]李亞娟.miR-29b在慢性粒細(xì)胞白血病細(xì)胞增殖及凋亡中的作用及其機(jī)制研究[D].重慶醫(yī)科大學(xué),2013.