背景^[1-3]

CALU-1人肺癌細胞是一種常用的細胞系，廣泛應(yīng)用于癌癥研究、毒理學(xué)實驗等領(lǐng)域。這種細胞系是從一名47歲的白人男性患者的肺鱗癌胸腔積液轉(zhuǎn)移病灶中分離出來的。CALU-1細胞表現(xiàn)出上皮細胞樣的形態(tài)，具有豐富的超微結(jié)構(gòu)特征，包括微絨毛、粗面內(nèi)質(zhì)網(wǎng)、溶酶體和脂包含體，并且不含有病毒顆粒。此外，這些細胞含有ras（H-ras和K-ras）癌基因。

在培養(yǎng)方面，CALU-1細胞在McCoy’s 5A培養(yǎng)基中生長，需要添加10%的胎牛血清和1%的抗生素/抗真菌劑。培養(yǎng)條件為37°C、5%CO2，并且建議每周更換培養(yǎng)基2-3次。傳代時，當細胞密度達到80%-90%時，可以使用0.25%胰蛋白酶-0.53mM EDTA消化細胞，然后按照1:2到1:4的比例傳代。

CALU-1細胞具有致瘤性，能在裸鼠身上形成表皮樣癌，在類固醇治療的倉鼠中形成轉(zhuǎn)移。這些細胞也表現(xiàn)出血型A、Rh+抗原表達，并具有HLA A10、A11、B15、Bw35的抗原譜。在分子水平上，它們是亞三倍體，模態(tài)染色體數(shù)目為62，存在7個頻繁出現(xiàn)的標記物。

CALU-1人肺癌細胞

CALU-1人肺癌細胞培養(yǎng)操作

1)復(fù)蘇CALU-1人肺癌細胞：以下細胞培養(yǎng)凍存處理僅供參考，具體操作步驟以隨貨產(chǎn)品說明書為主。

將含有1 mL細胞懸液的凍存管在37℃水浴中迅速搖晃解凍，加4 mL培養(yǎng)基混合均勻。在1000 rpm條件下離心3 min，棄去上清液，加1-2 mL培養(yǎng)基后吹勻。然后將所有細胞懸液加入含適量培養(yǎng)基的培養(yǎng)瓶中培養(yǎng)過夜（或?qū)⒓毎麘乙杭尤?0 cm皿中，加入約8 mL培養(yǎng)基，培養(yǎng)過夜）。第二天換液并檢查細胞密度。

2)CALU-1人肺癌細胞傳代：如果細胞密度達80%-90%，即可進行傳代培養(yǎng)。

a、棄去培養(yǎng)上清，用不含鈣、鎂離子的PBS潤洗細胞1-2次。

b、加1 mL消化液（0.25%Trypsin-0.53mM EDTA）于培養(yǎng)瓶中，使消化液浸潤所有細胞，棄去消化液，將培養(yǎng)瓶置于37℃培養(yǎng)箱中消化1 min，然后在顯微鏡下觀察細胞消化情況，若細胞大部分變圓并脫落，迅速拿回操作臺，輕敲幾下培養(yǎng)瓶后加少量培養(yǎng)基終止消化。

c、按6-8 mL/瓶補加培養(yǎng)基，輕輕打勻后裝入無菌離心管中，1000 rpm離心4 min，棄去上清液，補加1-2 mL培養(yǎng)液后吹勻。

d、將細胞懸液按1:2比例分到新的含8 mL培養(yǎng)基的新皿中或者瓶中，置于培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。

3)CALU-1人肺癌細胞凍存：待細胞生長狀態(tài)良好時，可進行細胞凍存。下面T25瓶為例；

a、收集細胞及細胞培養(yǎng)液，裝入無菌離心管中，1000 rpm條件下離心4 min，棄去上清液，用PBS清洗一遍，棄盡PBS，進行細胞計數(shù)。

b、根據(jù)細胞數(shù)量加入無血清細胞凍存液，使細胞密度5×106~1×107/mL，輕輕混勻，每支凍存管凍存1mL細胞懸液，注意凍存管做好標識。

c、將凍存管放入-80℃冰箱，24 h后轉(zhuǎn)入液氮灌儲存。記錄凍存管位置以便下次拿取。

應(yīng)用^[4][5]

CALU-1人肺癌細胞可以用于單核細胞在新型冠狀病毒引發(fā)的細胞因子風(fēng)暴中的作用和機制研究

圍繞單核細胞的功能和細胞因子分泌,來探討其在新型冠狀病毒引發(fā)的細胞因子風(fēng)暴中的作用和機制,以期對COVID-19的治療提供參考數(shù)據(jù)。已有研究表明,血管緊張素轉(zhuǎn)化酶2(ACE-2)為引起SARS冠狀病毒和新型冠狀病毒的主要結(jié)合受體。

本研究以流式細胞術(shù)和Western blotting檢測發(fā)現(xiàn),CALU-1人肺癌細胞表面高表達ACE-2蛋白。用SARS-Co V-2刺突蛋白S刺激CALU-1人肺癌細胞,經(jīng)i TRAQ蛋白組分析后與人類蛋白數(shù)據(jù)庫對比,發(fā)現(xiàn)GM-CSF和CD40L的表達明顯升高,可能導(dǎo)致肺上皮細胞通過CD40L/CD40途徑,調(diào)節(jié)肺部單核細胞活化和炎癥細胞因子的分泌。利用Western blotting和q RT-PCR方法,對i TRAQ蛋白檢測結(jié)果進行了印證。接下來,取來自志愿者提供的人濃縮白細胞,分離得到外周血單個核細胞(PBMC),建立肺上皮細胞與單核細胞共培養(yǎng)實驗,研究SARS-Co V-2激活單核細胞的作用和機制。

不同濃度的SARS-Co V-2-S刺激CALU-1人肺癌細胞,ELISA和PCR實驗分析GM-CSF的分泌和表達,流式細胞術(shù)分析CD40L的表達。結(jié)果表明,SARS-Co V-2-S可以顯著上調(diào)Calu-1細胞GM-CSF的分泌和CD40L的表達(P<0.01)。ACE-2抗體阻斷實驗證明,SARS-Co V-2-S作用于CALU-1人肺癌細胞依賴于ACE-2受體。SARS-Co V-2-S刺激Calu-1細胞與單核細胞后,檢測單核細胞表型和炎癥因子的分泌,流式細胞術(shù)檢測單核細胞表型。

結(jié)果顯示,CALU-1人肺癌細胞與單核細胞共培養(yǎng),并不能引起單核細胞表型變化,但是當在共培養(yǎng)體系中加入SARS-Co V-2-S后,單核細胞表達的CD86(2.1±0.22,P<0.05)和HLA-DR(3.5±0.32,P<0.01)顯著增高,提示單核細胞獲得了M1性巨噬細胞的炎癥表型。細胞內(nèi)染色和ELISA檢測結(jié)果表明,SARS-Co V-2-S通過Calu-1細胞刺激單核細胞分泌IL-18和IL-1β,說明SARS-Co V-2-S通過作用于肺上皮細胞激活單核細胞,促進了單核細胞向M1炎癥表型的分化。

Western blotting實驗結(jié)果表明,SARS-Co V-2-S通過激活CALU-1人肺癌細胞的PI3K/AKT,誘導(dǎo)肺上皮細胞分泌GM-CSF,并上調(diào)表達了CD40L。在SARSCo V-2-S刺激的Calu-1細胞與單核細胞共培養(yǎng)體系中,加入CD40的封閉抗體或GM-CSF的中和性抗體,單核細胞的CD86的表達和HLA-DR的表達明顯下降(P<0.05),細胞培養(yǎng)上清中的IL-18和IL-1β顯著下降(P<0.01)。以上結(jié)果表明,SARS-Co V-2-S激活CALU-1人肺癌細胞,通過CD40L/CD40和GM-CSF參與單核細胞的活化,引起單核細胞炎癥表型和炎癥細胞因子的分泌。

綜上所述,本研究探討了單核細胞在新型冠狀病毒引發(fā)的細胞因子風(fēng)暴中的作用和機制。發(fā)現(xiàn)了SARS-Co V-2通過S蛋白結(jié)合CALU-1人肺癌細胞表面ACE-2受體,激活細胞內(nèi)PI3K/AKT通路,誘導(dǎo)肺上皮細胞分泌GM-CSF,并上調(diào)表達了CD40L。激活Calu-1細胞,通過CD40L/CD40和GM-CSF參與單核細胞的活化,引起單核細胞炎癥表型和炎癥細胞因子的分泌。

參考文獻

[1]M1 macrophage exosomes engineered to foster M1 polarization and target the IL-4 receptor inhibit tumor growth by reprogramming tumor-associated macrophages into M1-like macrophages[J].Gunassekaran Gowri Rangaswamy;Poongkavithai Vadevoo Sri Murugan;Baek Moon-Chang;Lee Byungheon.Biomaterials,2021

[2]Mesenchymal Stem Cells in the Treatment of COVID-19,a Promising Future[J].Beghini Daniela Gois;Horita Samuel Iwao;HenriquesPons Andrea.Cells,2021

[3]SARS-CoV-2 nucleocapsid suppresses host pyroptosis by blocking Gasdermin D cleavage.[J].Ma Juan;Zhu Fangrui;Zhao Min;Shao Fei;Yu Dou;Ma Jiangwen;Zhang Xusheng;Li Weitao;Qian Yan;Zhang Yan;Jiang Dong;Wang Shuo;Xia Pengyan.The EMBO journal,2021

[4]Monocytes and Macrophages in COVID-19[J].Knoll Rainer;Schultze Joachim L.;Schulte Schrepping Jonas.Frontiers in Immunology,2021

[5]靳宇.單核細胞在新型冠狀病毒引發(fā)的細胞因子風(fēng)暴中的作用和機制研究[D].吉林大學(xué),2022.