背景^[1-3]

改良BIELSCHOWSKY神經(jīng)染色液是一種典型的鍍銀染色法，其基本原理為固定后的組織和切片浸染于銀溶液中，再用還原劑處理，使銀顆粒沉著在軸索的軸漿中，使之呈現(xiàn)深棕色或黑色。鍍銀后可在神經(jīng)元胞漿內(nèi)看到許多交錯(cuò)成網(wǎng)的細(xì)絲，并伸向樹(shù)突及軸突中。這種染色法常用于診斷和鑒別某些神經(jīng)系統(tǒng)腫瘤，如神經(jīng)纖維瘤、節(jié)細(xì)胞性神經(jīng)纖維瘤等呈現(xiàn)陽(yáng)性反應(yīng)，而神經(jīng)鞘瘤等則為陰性。

改良Bielschowsky神經(jīng)染色液由Bielschowsky硝酸銀溶液、還原劑、Bielschowsky氨銀溶液、氯化金溶液、海波溶液等組成。其特點(diǎn)包括滲透能力強(qiáng)、固定均勻、組織收縮小、染色效果好，且適用范圍廣，特別適合于富含結(jié)締組織的標(biāo)本和胚胎標(biāo)本，能夠軟化皮膚角質(zhì)，并可以用于植物組織的固定。此外，用該染色液固定的組織，細(xì)胞核及細(xì)胞漿染色十分清晰，特別是要顯示免疫球蛋白、病毒包涵體（如Negri小體）、骨骼肌的橫紋等組織時(shí)。

改良BIELSCHOWSKY神經(jīng)染色液

改良BIELSCHOWSKY神經(jīng)染色液通常包括以下改進(jìn)：

縮短染色時(shí)間：通過(guò)優(yōu)化染色液配方和染色條件，可以縮短染色時(shí)間，提高染色效率。

提高染色穩(wěn)定性：改良BIELSCHOWSKY神經(jīng)染色液通常采用更穩(wěn)定的染料和緩沖液，以減少染色過(guò)程中的失真和褪色。

增強(qiáng)對(duì)比度：改良BIELSCHOWSKY神經(jīng)染色液通常采用更高強(qiáng)度的染料或添加其他染料來(lái)增強(qiáng)對(duì)比度，使神經(jīng)纖維更容易被觀察和識(shí)別。

在使用改良Bielschowsky神經(jīng)染色液時(shí)，一般需要進(jìn)行以下步驟：首先，石蠟切片至8～15μm，脫蠟至水洗；然后，用蒸餾水洗1～2分鐘；接著，將切片放入Bielschowsky硝酸銀溶液中，并在37℃溫箱內(nèi)避光浸染25～35分鐘；之后，再用蒸餾水洗2～3分鐘；隨后，用還原劑還原數(shù)秒，至切片呈現(xiàn)黃色為止；最后，用蒸餾水洗3～5分鐘。

請(qǐng)注意，由于染色液中含有某些成分，可能會(huì)溶解火棉膠，因此如果用于火棉膠包埋的標(biāo)本，需要進(jìn)行洗脫處理。此外，標(biāo)本尺寸不可太大，一般窄邊不大于5mm。

應(yīng)用^[4][5]

改良BIELSCHOWSKY神經(jīng)染色液可以用于HMGB1對(duì)大鼠脊髓損傷后反應(yīng)性星形膠質(zhì)細(xì)胞引導(dǎo)軸突生長(zhǎng)的作用及其機(jī)制

SD大鼠脊髓損傷(Spinal cord injury,SCI)后,抑制高遷移率族蛋白B1(High Mobility Group Box1,HMGB1)釋放,觀察脊髓損傷部位中星形膠質(zhì)細(xì)胞(Astrocytes,Ast)極化相關(guān)蛋白的表達(dá),軸突生長(zhǎng)情況與運(yùn)動(dòng)功能的恢復(fù)情況。通過(guò)對(duì)體外培養(yǎng)的大鼠Ast進(jìn)行劃痕損傷,觀察星形膠質(zhì)細(xì)胞極化與HMGB1、Cdc42、α-Actinin4蛋白表達(dá)情況,探討HMGB1對(duì)大鼠SCI后星形膠質(zhì)細(xì)胞極化引導(dǎo)軸突生長(zhǎng)與運(yùn)動(dòng)功能恢復(fù)的作用及其機(jī)制。

方法:觀察大鼠脊髓1損傷后的星形膠質(zhì)細(xì)胞極化情況以及軸突損傷情況。將SD大鼠分為6組:假手術(shù)組(sham組)、模型組SCI 12h、1d、3d、5d、7d組;使用改良Allen法建立SCI模型后,觀察其星形膠質(zhì)細(xì)胞極化情況與軸突損傷情況。應(yīng)用酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)(ELISA)檢測(cè)各組大鼠SCI后外周血清中促炎因子HMGB1表達(dá)量;應(yīng)用蛋白免疫印跡(Western Blot,WB)檢測(cè)各組大鼠SCI后不同時(shí)間點(diǎn)脊髓中HMGB1、GFAP、Cdc42表達(dá)情況;同時(shí)應(yīng)用HE染色和改良BIELSCHOWSKY神經(jīng)染色液染色觀察SCI后脊髓與軸突損傷情況。觀察體外培養(yǎng)的星形膠質(zhì)細(xì)胞劃痕損傷后的形態(tài)變化情況。培養(yǎng)取自48h內(nèi)新生的SD大鼠乳鼠的脊髓Ast,建立劃痕損傷模型。實(shí)驗(yàn)共分為5組:正常組(Normal組,正常培養(yǎng)的大鼠脊髓Ast,不做任何處理)、劃痕損傷6h(劃痕損傷6小時(shí)的大鼠脊髓Ast)、劃痕損傷12h(劃痕損傷12小時(shí)的大鼠脊髓Ast)、劃痕損傷24h(劃痕損傷24小時(shí)的大鼠脊髓Ast)、劃痕損傷48h(劃痕損傷48小時(shí)的大鼠脊髓Ast)。通過(guò)光學(xué)顯微鏡觀察各組星形膠質(zhì)細(xì)胞的形態(tài)變化。此部分實(shí)驗(yàn)可以探究SCI后不同時(shí)間點(diǎn)中星形膠質(zhì)細(xì)胞極化最明顯的時(shí)間點(diǎn),以支持后續(xù)實(shí)驗(yàn)。

探究抑制HMGB1后,大鼠脊髓Ast極化情況,軸突生長(zhǎng)情況以及運(yùn)動(dòng)功能恢復(fù)情況。將SD大鼠分為4組:Sham組、SCI組、SCI+EP(HMGB1抑制劑丙酮酸乙酯)組、SCI+GL(HMGB1抑制劑甘草甜素)組,應(yīng)用ELISA檢測(cè)各組大鼠外周血清中促炎因子HMGB1的表達(dá)量;應(yīng)用WB檢測(cè)各組大鼠脊髓中HMGB1、GFAP、Cdc42、α-Actinin4的表達(dá)情況;同時(shí)應(yīng)用改良BIELSCHOWSKY神經(jīng)染色液染色觀察SCI后脊髓軸突生長(zhǎng)情況;通過(guò)觀察與測(cè)試評(píng)價(jià)各組大鼠運(yùn)動(dòng)功能恢復(fù)情況。觀察抑制HMGB1后,體外培養(yǎng)的大鼠脊髓Ast的極化情況。利用轉(zhuǎn)染攜帶HMGB1沉默基因的慢病毒干擾細(xì)胞核部位蛋白的表達(dá),并采用丙酮酸乙酯(EP)抑制HMGB1的表達(dá)。細(xì)胞分為6組:Normal組、Model組、外源性HMGB1組(Model+r HMGB1,細(xì)胞劃痕后加入外源性HMGB1)、sh RNA轉(zhuǎn)染組(Model+HMGB1sh RNA,正常星形膠質(zhì)細(xì)胞與攜帶HMGB1沉默基因的慢病毒共同培養(yǎng)后進(jìn)行細(xì)胞劃痕)、陰性序列轉(zhuǎn)染組(Model+non-targeting sh RNA,將正常星形膠質(zhì)細(xì)胞與攜帶對(duì)HMGB1基因無(wú)影響的慢病毒共同培養(yǎng)后進(jìn)行細(xì)胞劃痕)以及Model+EP組(細(xì)胞劃痕后加EP)。使用WB檢測(cè)上述各組HMGB1、Cdc42、α-Actinin4表達(dá)情況,并通過(guò)光學(xué)顯微鏡觀察各組星形膠質(zhì)細(xì)胞的形態(tài)變化。

探討大鼠SCI后抑制HMGB1對(duì)反應(yīng)性星形膠質(zhì)細(xì)胞引導(dǎo)軸突生長(zhǎng)的可能機(jī)制。將大鼠分為6組:Sham組、SCI組、SCI+EP組、SCI+LPS(Toll樣受體4激動(dòng)劑脂多糖)組、SCI+LY(PI3K抑制劑LY294002)組、SCI+Casin(Cdc42抑制劑)組。WB檢測(cè)各組大鼠脊髓組織中HMGB1、TLR4、PI3K以及Cdc42的表達(dá)量。應(yīng)用改良BIELSCHOWSKY神經(jīng)染色液染色觀察SCI后各組脊髓軸突生長(zhǎng)情況。研究HMGB1通過(guò)Toll樣受體4(TLR4)/磷脂酰肌醇3-激酶(PI3K)通路對(duì)大鼠脊髓Ast損傷后極化的調(diào)節(jié)作用。

參考文獻(xiàn)

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