背景^[1-3]

DH5Α感受態(tài)細(xì)胞是一種可以用于常規(guī)質(zhì)粒高效轉(zhuǎn)化的質(zhì)?？寺』瘜W(xué)感受態(tài)細(xì)胞，是實(shí)驗(yàn)室最為常用的大腸桿菌菌株之一。它廣泛用于基因克隆、藍(lán)白篩選、質(zhì)粒穩(wěn)定擴(kuò)增等分子生物學(xué)實(shí)驗(yàn)。

DH5Α感受態(tài)細(xì)胞的遺傳特性使其對(duì)外源DNA的攝取和質(zhì)粒的穩(wěn)定保持具有高效性。這種細(xì)胞經(jīng)過(guò)特殊處理，如電擊法或CaCl2法等，使得細(xì)胞膜的通透性發(fā)生暫時(shí)性的改變，從而允許外源DNA分子進(jìn)入，即成為感受態(tài)細(xì)胞。

DH5α菌株具有一些特殊的遺傳特點(diǎn)，如缺失核酸內(nèi)切酶（endA），這有助于提高質(zhì)粒DNA的產(chǎn)量和質(zhì)量；同時(shí)，它是重組酶缺陷型（recA），這減少了插入片段的同源重組概率，保證了插入DNA的穩(wěn)定性。此外，lacZΔM15是表達(dá)β-半乳糖苷酶α片段的一段基因，當(dāng)M15缺失時(shí)，雖然lacZ基因能表達(dá)ω片段，但不能表達(dá)α片段，這使得β-半乳糖苷酶沒(méi)有活性。因此，DH5Α感受態(tài)細(xì)胞可以用于藍(lán)白斑篩選。

使用pUC19質(zhì)粒進(jìn)行熱激活轉(zhuǎn)化時(shí)，DH5Α感受態(tài)細(xì)胞的轉(zhuǎn)化效率可以高達(dá)1×10^8 cfu/μg DNA以上。其高轉(zhuǎn)化效率和穩(wěn)定性使其在分子生物學(xué)實(shí)驗(yàn)中起到了關(guān)鍵作用，為基因工程和基因克隆提供了有效的工具。

DH5Α感受態(tài)細(xì)胞

DH5Α感受態(tài)細(xì)胞具體步驟如下：

a.將DH5α菌株接種到含有適當(dāng)抗生素的LB培養(yǎng)基上，37°C培養(yǎng)過(guò)夜。

b.取一定量的菌液，離心收集細(xì)菌沉淀。

c.用冰預(yù)冷的CaCl2溶液重懸細(xì)菌沉淀，使其濃度約為10^9 CFU/mL。

d.將重懸后的細(xì)菌懸液在冰上放置30分鐘。

e.將冰上的細(xì)菌懸液離心收集細(xì)菌沉淀，棄去上清液。

f.用冰預(yù)冷的DMSO溶液重懸細(xì)菌沉淀，使其濃度約為10^9 CFU/mL。

g.將重懸后的細(xì)菌懸液分裝到無(wú)菌的凍存管中，每管100μL。

h.將凍存管放入-80°C冰箱中保存，至少需要24小時(shí)才能使用。

應(yīng)用^[4][5]

DH5Α感受態(tài)細(xì)胞可以用于超聲波介導(dǎo)質(zhì)粒pUC19轉(zhuǎn)化大腸桿菌DH5α感受態(tài)細(xì)胞轉(zhuǎn)化方法及機(jī)制的研究

利用超聲波介導(dǎo)質(zhì)粒p UC19轉(zhuǎn)化大腸桿菌(Escherichia coli,E.coli)DH5Α感受態(tài)細(xì)胞。通過(guò)對(duì)超聲波介導(dǎo)外源DNA轉(zhuǎn)化宿主細(xì)胞模型的建立、E.coli DH5Α感受態(tài)細(xì)胞壁成分肽聚糖與金屬離子間的吸附關(guān)系、超聲波處理前后E.coli DH5Α感受態(tài)細(xì)胞膜通透性的變化、生物大分子物質(zhì)含量的變化以及E.coli DH5Α感受態(tài)細(xì)胞外膜蛋白mrd B基因突變株的構(gòu)建方面進(jìn)行研究,以期揭示轉(zhuǎn)化發(fā)生的機(jī)制。研究結(jié)果表明,在二價(jià)金屬離子環(huán)境中,適宜條件的超聲波可介導(dǎo)外源DNA轉(zhuǎn)化進(jìn)入宿主細(xì)胞。在本實(shí)驗(yàn)中當(dāng)E.coli DH5Α感受態(tài)細(xì)胞菌液OD600=0.40.6,超聲功率為40 W時(shí),在35℃下處理E.coli DH5Α感受態(tài)細(xì)胞和質(zhì)粒p UC19的混合液25 s,質(zhì)粒p UC19轉(zhuǎn)化E.coli DH5α細(xì)胞的轉(zhuǎn)化效率最大可以達(dá)到1.006×107 CFU/μg DNA。

對(duì)超聲波處理前后E.coli DH5α細(xì)胞膜通透性的變化研究結(jié)果顯示,在最佳轉(zhuǎn)化條件下細(xì)胞膜通透性的變化是未經(jīng)超聲波處理的細(xì)胞膜通透性的10倍,然而不同超聲波條件下的轉(zhuǎn)化效率的變化與細(xì)胞膜通透性的變化不成正比,也與E.coli DH5Α感受態(tài)細(xì)胞存活率的變化不成正比,這是因?yàn)樵谧罴艳D(zhuǎn)化條件菌液OD600值為0.40.6、超聲波功率為40 W、在溫度為35℃下處理25 s,超聲波作用對(duì)質(zhì)粒DNA的完整性沒(méi)有損傷,對(duì)宿主細(xì)胞的破壞也很小,但超出此范圍后,質(zhì)粒DNA的完整性受到破壞,同時(shí)宿主細(xì)胞由于其自身的調(diào)控與修復(fù)導(dǎo)致轉(zhuǎn)化率的不一致。

E.coli DH5Α感受態(tài)細(xì)胞壁成分肽聚糖與金屬離子、DNA互作結(jié)果顯示肽聚糖對(duì)金屬離子的吸附?jīng)]有專一性,無(wú)論是一價(jià)(Na+)金屬離子還是二價(jià)(Mg2+、Ca2+)金屬離子,肽聚糖均可與其發(fā)生吸附作用,但與DNA不能發(fā)生反應(yīng),證明在轉(zhuǎn)化發(fā)生時(shí)必不可少的二價(jià)金屬離子(Ca2+)有一部分與細(xì)胞壁成分肽聚糖發(fā)生了反應(yīng),為外源DNA進(jìn)入宿主細(xì)胞提供了離子通道,但尚不能證明肽聚糖的存在決定轉(zhuǎn)化的發(fā)生。對(duì)超聲波處理前后宿主細(xì)胞E.coli DH5Α感受態(tài)細(xì)胞中的生物大分子物質(zhì)檢測(cè)以及掃描電子顯微鏡與原子力顯微鏡觀察結(jié)果顯示,超聲波產(chǎn)生的氣穴與聲穴效應(yīng)改變了宿主細(xì)胞的膜通透性、胞內(nèi)結(jié)構(gòu)等,導(dǎo)致胞內(nèi)大分子物質(zhì)透過(guò)細(xì)胞膜向胞外溢出,致使超聲波處理后的細(xì)胞出現(xiàn)褶皺、形態(tài)不均等現(xiàn)象。

參考文獻(xiàn)

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