背景及概述^[1]

腈化合物是一類含腈基功能團(tuán)的化學(xué)物質(zhì)(R-CN)，是一種重要的合成原料。它們種類繁多，常見的如氰酸、乙腈、丙烯腈、苯甲腈、苯乙腈、3-腈基吡啶、3-吲哚乙腈、氰酸等。由腈化合物出發(fā)可以獲得酰胺、酸、酯等價(jià)值更高、應(yīng)用范圍更廣的一類化合物，它們被廣泛的應(yīng)用于化工原料、醫(yī)藥中間體、維生素的前體。腈水解酶最早是由Thiman和Mahadevan在1964年的時(shí)候從大麥葉中分離出來，能夠?qū)⑦胚嵋译嫠獬蔀檫胚嵋宜?，故將其命名為吲哚乙腈水解酶。但是在后來的研究中發(fā)現(xiàn)，該純酶對(duì)26種不同的腈化合物均具有活性，它水解3-氰基吡啶的活力是吲哚乙腈的8倍。因此Thiman和Mahadevan將其命名為腈水解酶。

結(jié)構(gòu)及其酶作用機(jī)制^[1]

最初認(rèn)為腈水解酶是用來水解芳香族腈化合物和不飽和脂肪族腈化物，而飽和脂肪族腈化物則是由腈水合酶與酰胺酶共同作用降解的。也有報(bào)道說腈水解酶分為三類：脂肪腈水解酶、芳香腈或雜環(huán)腈水解酶和乙酰腈水解酶。但從近年的研究看來這種看法未免簡(jiǎn)單化，實(shí)際上腈化物的反應(yīng)途徑取決于底物的立體因素及電子因素。所以在不同底物的誘導(dǎo)下，同一來源的腈水解酶有不同的活性，如下表所示。

從上表也可以看出不同來源的腈水解酶的亞基分子量和天然構(gòu)象也不盡相同，許多腈水解酶包含相同的多肽，分子量為40kD左右(32～45kD)。不同的酶又是有不同數(shù)量的亞基聚合而成，一般的亞基數(shù)為2～26。F.oxysporum中的腈水解酶在PAGE凝膠出現(xiàn)多條帶，分子量范圍為170～880kD，相隔的兩條帶之間相差70kD(2×34kD)。每條帶都具有催化能力，這也表明由4～26個(gè)亞基組成的酶都具有活性，而且亞基一般都是成對(duì)出現(xiàn)。

R.rhodochrousPA-34中的腈水解酶以分子量為45kD的單個(gè)亞基的形式存在。能降解溴苯腈的K.pneumoniaessp.ozaenae產(chǎn)生的水解酶以二聚體的形式存在。另外在不同的培養(yǎng)條件下，菌體產(chǎn)生的水解酶也有所差異。篩選到的NocardiaNcib11216分別在苯甲腈是否存在的條件下培養(yǎng)，當(dāng)沒有苯甲腈存在的情況下，純化得到的酶經(jīng)凝膠過濾測(cè)得分子量為47kD；而在苯甲腈存在的情況下，純化得到的酶分子量為560kD。另外，亞基的聚合和pH值、溫度以及酶的濃度有關(guān)，該酶的聚合pH值為7.3，當(dāng)溫度低于20℃時(shí)，聚合速度十分緩慢。

應(yīng)用^[1-2]

1.在醫(yī)藥中間體合成中的應(yīng)用

近幾年來腈水解酶的生物催化技術(shù)正突飛猛進(jìn)的發(fā)展，尤其是在醫(yī)藥中間體生產(chǎn)中的應(yīng)用已經(jīng)取得了矚目的成就，相關(guān)文獻(xiàn)發(fā)表和專利申報(bào)呈現(xiàn)穩(wěn)健增長(zhǎng)之勢(shì)?？傮w來看，最近幾年腈水解酶在醫(yī)藥中間體合成中的應(yīng)用主要集中于吡啶甲酸、扁桃酸及其衍生物、單腈單酸以及藥用氨基酸等這幾大類化合物。

1）吡啶甲酸

吡啶甲酸包括煙酸、異煙酸和2-吡啶甲酸這三種同分異構(gòu)體。煙酸也稱維生素PP或維生素B3，是人體必需的13種維生素之一，作為藥物中間體可合成多種用于治療皮膚性疾病、高血壓癥和冠心病等的藥物，也可用于制備異煙肼、尼可剎米及煙酸肌醇酯；異煙酸是合成抗結(jié)核藥物的中間體，其衍生物異煙酰肼和異煙酰腙即用作抗結(jié)核藥物；2-吡啶甲酸在醫(yī)藥生產(chǎn)中用于制備卡波卡因藥物，還可降低糖尿病人的血糖水平和胰島素抗藥性，而且能預(yù)防心腦血管病。

2）扁桃酸及其衍生物

扁桃酸在醫(yī)藥領(lǐng)域具有重要的應(yīng)用，可用于合成頭孢菌素、血管緊張肽轉(zhuǎn)化酶抑制劑、抗肥胖藥物及抗腫瘤藥物等，也可用作防腐劑。由于單一構(gòu)型的扁桃酸與外消旋扁桃酸相比藥效更高、副作用更低，具有廣闊的市場(chǎng)前景，采用高立體選擇性的腈水解酶拆分外消旋的扁桃腈合成單一對(duì)映體扁桃酸受到了廣泛關(guān)注。

以正丁腈為誘導(dǎo)劑培養(yǎng)的糞產(chǎn)堿菌(A．faecalis)ATCC8750腈水解酶對(duì)扁桃腈具有較高特異性，用游離細(xì)胞催化劑選擇性催化外消旋扁桃腈可生成相應(yīng)(Ｒ)扁桃酸，產(chǎn)物收率為91%，ee值可達(dá)100%。將惡臭假單胞菌(P．putida)MTCC5110腈水解酶基因在大腸桿菌中進(jìn)行了重組表達(dá)，并對(duì)產(chǎn)酶條件進(jìn)行了系統(tǒng)優(yōu)化，重組酶對(duì)扁桃腈表現(xiàn)出較高的腈水解酶活力，最終轉(zhuǎn)化結(jié)果表明(Ｒ)-扁桃酸的收率及ee值分別達(dá)到87%和99.99%。

3）單腈單酸

單腈單酸作為藥物中間體十分常見，采用二腈類化合物進(jìn)行選擇性水解即可制備。然而常規(guī)的化學(xué)水解很難一步實(shí)現(xiàn)該反應(yīng)，并且產(chǎn)率難以提升，而采用酶法則有望解決該問題。擴(kuò)增獲得一株敏捷食酸菌(Acidovoraxfacilis)72W的腈水解酶編碼基因，并在大腸桿菌中進(jìn)行了過量表達(dá)，重組酶對(duì)脂肪族二腈具有較強(qiáng)的立體選擇性，能將2-甲基戊二腈轉(zhuǎn)化為4-氰基戊酸，底物轉(zhuǎn)化率達(dá)到100%，產(chǎn)物中無酰胺化合物生成，2-甲基戊二酸是唯一的副產(chǎn)物且含量低于2%；進(jìn)一步使用固定化細(xì)胞進(jìn)行連續(xù)批次轉(zhuǎn)化，催化劑可重復(fù)利用195個(gè)批次，催化劑產(chǎn)率為3500g4-氰基戊酸/g干細(xì)胞，并且最終催化劑仍能保留67%的腈水解酶活性。

4）藥用氨基酸

氨基酸在醫(yī)藥上的關(guān)鍵作用正日益受到人們重視，應(yīng)用范圍也越來越廣泛。采用腈水解酶介導(dǎo)的生物催化合成途徑是藥用氨基酸生產(chǎn)工業(yè)中的一條重要途徑。作為藥用氨基酸中間體原料，除天然氨基酸外，越來越多的非天然氨基酸也逐步開發(fā)出來。D-苯甘氨酸是合成多種抗生素的中間體，如氨芐青霉素和頭孢氨芐等。文獻(xiàn)報(bào)道鞘氨醇單胞菌(S．wittichii)ＲW1重組腈水解酶能特異性水解苯胺基乙腈合成D-苯甘氨酸，采用水-1-辛醇的兩相體系進(jìn)行轉(zhuǎn)化，在25℃，100mM底物的情況下，通過48h轉(zhuǎn)化，最高產(chǎn)物收率為81%，ee值也保持在95%以上。

2. 腈水解酶在腈綸及滌綸改性中的應(yīng)用　

近年來，隨著“綠色生產(chǎn)”呼聲的提高，生物酶在紡織染整工業(yè)上的應(yīng)用日漸得到人們的關(guān)注。腈水解酶作為一種生物催化劑，具有高度的專一性，高效性(比一般催化劑高106～1013倍)，催化反應(yīng)條件溫和、可降低能耗、節(jié)省能源、催化活性可調(diào)節(jié)控制等特點(diǎn)，用于紡織品的濕加工具有獨(dú)特的優(yōu)點(diǎn)。腈水解酶用于紡織品整理，能從一定程度上改善織物的外觀與手感。同時(shí)酶是蛋白質(zhì)，本身無毒，且容易生物降解，用腈水解酶取代染整加工中的部分酸、堿、氧化劑等化工原料，可大大降低污水排放，減輕環(huán)境污染，所以生物酶加工作為綠色生產(chǎn)工藝具有極大的發(fā)展?jié)摿?。而且由于酶多為大分子蛋白質(zhì)，而腈綸分子結(jié)構(gòu)規(guī)整致密，所以酶對(duì)腈綸上氰基的催化水解主要停留在纖維表面，不致于影響纖維大分子主鏈的結(jié)構(gòu)，可以保持腈綸原有的優(yōu)異的物理機(jī)械性能。

主要參考資料

[1] 腈水解酶在醫(yī)藥中間體生物催化研究中的最新進(jìn)展

[2] 腈水解酶的來源、結(jié)構(gòu)、作用機(jī)制及其應(yīng)用*