背景及概述^[1]

腈化合物是一類含腈基功能團的化學物質(R-CN)，是一種重要的合成原料。它們種類繁多，常見的如氰酸、乙腈、丙烯腈、苯甲腈、苯乙腈、3-腈基吡啶、3-吲哚乙腈、氰酸等。由腈化合物出發(fā)可以獲得酰胺、酸、酯等價值更高、應用范圍更廣的一類化合物，它們被廣泛的應用于化工原料、醫(yī)藥中間體、維生素的前體。腈水解酶最早是由Thiman和Mahadevan在1964年的時候從大麥葉中分離出來，能夠將吲哚乙腈水解成為吲哚乙酸，故將其命名為吲哚乙腈水解酶。但是在后來的研究中發(fā)現(xiàn)，該純酶對26種不同的腈化合物均具有活性，它水解3-氰基吡啶的活力是吲哚乙腈的8倍。因此Thiman和Mahadevan將其命名為腈水解酶。

結構及其酶作用機制^[1]

最初認為腈水解酶是用來水解芳香族腈化合物和不飽和脂肪族腈化物，而飽和脂肪族腈化物則是由腈水合酶與酰胺酶共同作用降解的。也有報道說腈水解酶分為三類：脂肪腈水解酶、芳香腈或雜環(huán)腈水解酶和乙酰腈水解酶。但從近年的研究看來這種看法未免簡單化，實際上腈化物的反應途徑取決于底物的立體因素及電子因素。所以在不同底物的誘導下，同一來源的腈水解酶有不同的活性，如下表所示。

從上表也可以看出不同來源的腈水解酶的亞基分子量和天然構象也不盡相同，許多腈水解酶包含相同的多肽，分子量為40kD左右(32～45kD)。不同的酶又是有不同數(shù)量的亞基聚合而成，一般的亞基數(shù)為2～26。F.oxysporum中的腈水解酶在PAGE凝膠出現(xiàn)多條帶，分子量范圍為170～880kD，相隔的兩條帶之間相差70kD(2×34kD)。每條帶都具有催化能力，這也表明由4～26個亞基組成的酶都具有活性，而且亞基一般都是成對出現(xiàn)。

R.rhodochrousPA-34中的腈水解酶以分子量為45kD的單個亞基的形式存在。能降解溴苯腈的K.pneumoniaessp.ozaenae產生的水解酶以二聚體的形式存在。另外在不同的培養(yǎng)條件下，菌體產生的水解酶也有所差異。篩選到的NocardiaNcib11216分別在苯甲腈是否存在的條件下培養(yǎng)，當沒有苯甲腈存在的情況下，純化得到的酶經凝膠過濾測得分子量為47kD；而在苯甲腈存在的情況下，純化得到的酶分子量為560kD。另外，亞基的聚合和pH值、溫度以及酶的濃度有關，該酶的聚合pH值為7.3，當溫度低于20℃時，聚合速度十分緩慢。

應用^[1-2]

1.在醫(yī)藥中間體合成中的應用

近幾年來腈水解酶的生物催化技術正突飛猛進的發(fā)展，尤其是在醫(yī)藥中間體生產中的應用已經取得了矚目的成就，相關文獻發(fā)表和專利申報呈現(xiàn)穩(wěn)健增長之勢?？傮w來看，最近幾年腈水解酶在醫(yī)藥中間體合成中的應用主要集中于吡啶甲酸、扁桃酸及其衍生物、單腈單酸以及藥用氨基酸等這幾大類化合物。

1）吡啶甲酸

吡啶甲酸包括煙酸、異煙酸和2-吡啶甲酸這三種同分異構體。煙酸也稱維生素PP或維生素B3，是人體必需的13種維生素之一，作為藥物中間體可合成多種用于治療皮膚性疾病、高血壓癥和冠心病等的藥物，也可用于制備異煙肼、尼可剎米及煙酸肌醇酯；異煙酸是合成抗結核藥物的中間體，其衍生物異煙酰肼和異煙酰腙即用作抗結核藥物；2-吡啶甲酸在醫(yī)藥生產中用于制備卡波卡因藥物，還可降低糖尿病人的血糖水平和胰島素抗藥性，而且能預防心腦血管病。

2）扁桃酸及其衍生物

扁桃酸在醫(yī)藥領域具有重要的應用，可用于合成頭孢菌素、血管緊張肽轉化酶抑制劑、抗肥胖藥物及抗腫瘤藥物等，也可用作防腐劑。由于單一構型的扁桃酸與外消旋扁桃酸相比藥效更高、副作用更低，具有廣闊的市場前景，采用高立體選擇性的腈水解酶拆分外消旋的扁桃腈合成單一對映體扁桃酸受到了廣泛關注。

以正丁腈為誘導劑培養(yǎng)的糞產堿菌(A．faecalis)ATCC8750腈水解酶對扁桃腈具有較高特異性，用游離細胞催化劑選擇性催化外消旋扁桃腈可生成相應(Ｒ)扁桃酸，產物收率為91%，ee值可達100%。將惡臭假單胞菌(P．putida)MTCC5110腈水解酶基因在大腸桿菌中進行了重組表達，并對產酶條件進行了系統(tǒng)優(yōu)化，重組酶對扁桃腈表現(xiàn)出較高的腈水解酶活力，最終轉化結果表明(Ｒ)-扁桃酸的收率及ee值分別達到87%和99.99%。

3）單腈單酸

單腈單酸作為藥物中間體十分常見，采用二腈類化合物進行選擇性水解即可制備。然而常規(guī)的化學水解很難一步實現(xiàn)該反應，并且產率難以提升，而采用酶法則有望解決該問題。擴增獲得一株敏捷食酸菌(Acidovoraxfacilis)72W的腈水解酶編碼基因，并在大腸桿菌中進行了過量表達，重組酶對脂肪族二腈具有較強的立體選擇性，能將2-甲基戊二腈轉化為4-氰基戊酸，底物轉化率達到100%，產物中無酰胺化合物生成，2-甲基戊二酸是唯一的副產物且含量低于2%；進一步使用固定化細胞進行連續(xù)批次轉化，催化劑可重復利用195個批次，催化劑產率為3500g4-氰基戊酸/g干細胞，并且最終催化劑仍能保留67%的腈水解酶活性。

4）藥用氨基酸

氨基酸在醫(yī)藥上的關鍵作用正日益受到人們重視，應用范圍也越來越廣泛。采用腈水解酶介導的生物催化合成途徑是藥用氨基酸生產工業(yè)中的一條重要途徑。作為藥用氨基酸中間體原料，除天然氨基酸外，越來越多的非天然氨基酸也逐步開發(fā)出來。D-苯甘氨酸是合成多種抗生素的中間體，如氨芐青霉素和頭孢氨芐等。文獻報道鞘氨醇單胞菌(S．wittichii)ＲW1重組腈水解酶能特異性水解苯胺基乙腈合成D-苯甘氨酸，采用水-1-辛醇的兩相體系進行轉化，在25℃，100mM底物的情況下，通過48h轉化，最高產物收率為81%，ee值也保持在95%以上。

2. 腈水解酶在腈綸及滌綸改性中的應用　

近年來，隨著“綠色生產”呼聲的提高，生物酶在紡織染整工業(yè)上的應用日漸得到人們的關注。腈水解酶作為一種生物催化劑，具有高度的專一性，高效性(比一般催化劑高106～1013倍)，催化反應條件溫和、可降低能耗、節(jié)省能源、催化活性可調節(jié)控制等特點，用于紡織品的濕加工具有獨特的優(yōu)點。腈水解酶用于紡織品整理，能從一定程度上改善織物的外觀與手感。同時酶是蛋白質，本身無毒，且容易生物降解，用腈水解酶取代染整加工中的部分酸、堿、氧化劑等化工原料，可大大降低污水排放，減輕環(huán)境污染，所以生物酶加工作為綠色生產工藝具有極大的發(fā)展?jié)摿?。而且由于酶多為大分子蛋白質，而腈綸分子結構規(guī)整致密，所以酶對腈綸上氰基的催化水解主要停留在纖維表面，不致于影響纖維大分子主鏈的結構，可以保持腈綸原有的優(yōu)異的物理機械性能。

主要參考資料

[1] 腈水解酶在醫(yī)藥中間體生物催化研究中的最新進展

[2] 腈水解酶的來源、結構、作用機制及其應用*