背景^[1-3]

RAT1大鼠成纖維細(xì)胞系是細(xì)胞生物學(xué)中的一種細(xì)胞系，由特定的實(shí)驗(yàn)條件和培養(yǎng)方法得到。它是一種特定的細(xì)胞系，主要用于科學(xué)研究，以探索細(xì)胞生長(zhǎng)、分化、代謝等方面的機(jī)制。

Rat1大鼠成纖維細(xì)胞系在研究中具有一定的應(yīng)用價(jià)值，例如在藥物篩選、毒理學(xué)研究、基因功能研究等領(lǐng)域中都發(fā)揮著重要作用。通過使用Rat1大鼠成纖維細(xì)胞系，科學(xué)家們可以更好地了解細(xì)胞生長(zhǎng)和分化的過程，探索藥物的作用機(jī)制，以及研究基因?qū)?xì)胞生長(zhǎng)和分化的影響等。

RAT1大鼠成纖維細(xì)胞系

RAT1大鼠成纖維細(xì)胞系細(xì)胞培養(yǎng)操作

1)復(fù)蘇RAT1大鼠成纖維細(xì)胞系細(xì)胞：以下細(xì)胞培養(yǎng)凍存處理僅供參考，具體操作步驟以隨貨產(chǎn)品說明書為主。

將含有1 mL細(xì)胞懸液的凍存管在37℃水浴中迅速搖晃解凍，加4 mL培養(yǎng)基混合均勻。在1000 rpm條件下離心3 min，棄去上清液，加1-2 mL培養(yǎng)基后吹勻。然后將所有細(xì)胞懸液加入含適量培養(yǎng)基的培養(yǎng)瓶中培養(yǎng)過夜（或?qū)⒓?xì)胞懸液加入10 cm皿中，加入約8 mL培養(yǎng)基，培養(yǎng)過夜）。第二天換液并檢查細(xì)胞密度。

2)RAT1大鼠成纖維細(xì)胞系細(xì)胞傳代：如果細(xì)胞密度達(dá)80%-90%，即可進(jìn)行傳代培養(yǎng)。

a、棄去培養(yǎng)上清，用不含鈣、鎂離子的PBS潤(rùn)洗細(xì)胞1-2次。

b、加1 mL消化液（0.25%Trypsin-0.53mM EDTA）于培養(yǎng)瓶中，使消化液浸潤(rùn)所有細(xì)胞，棄去消化液，將培養(yǎng)瓶置于37℃培養(yǎng)箱中消化1 min，然后在顯微鏡下觀察細(xì)胞消化情況，若細(xì)胞大部分變圓并脫落，迅速拿回操作臺(tái)，輕敲幾下培養(yǎng)瓶后加少量培養(yǎng)基終止消化。

c、按6-8 mL/瓶補(bǔ)加培養(yǎng)基，輕輕打勻后裝入無菌離心管中，1000 rpm離心4 min，棄去上清液，補(bǔ)加1-2 mL培養(yǎng)液后吹勻。

d、將細(xì)胞懸液按1:2比例分到新的含8 mL培養(yǎng)基的新皿中或者瓶中，置于培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。

3)RAT1大鼠成纖維細(xì)胞系細(xì)胞凍存：待細(xì)胞生長(zhǎng)狀態(tài)良好時(shí)，可進(jìn)行細(xì)胞凍存。下面T25瓶為例；

a、收集細(xì)胞及細(xì)胞培養(yǎng)液，裝入無菌離心管中，1000 rpm條件下離心4 min，棄去上清液，用PBS清洗一遍，棄盡PBS，進(jìn)行細(xì)胞計(jì)數(shù)。

b、根據(jù)細(xì)胞數(shù)量加入無血清細(xì)胞凍存液，使細(xì)胞密度5×106~1×107/mL，輕輕混勻，每支凍存管凍存1mL細(xì)胞懸液，注意凍存管做好標(biāo)識(shí)。

c、將凍存管放入-80℃冰箱，24 h后轉(zhuǎn)入液氮灌儲(chǔ)存。記錄凍存管位置以便下次拿取。

應(yīng)用^[4-5]

RAT1大鼠成纖維細(xì)胞系可以用于糖尿病大鼠來源成纖維細(xì)胞外泌體對(duì)創(chuàng)面愈合的影響

研究糖尿病大鼠來源的成纖維細(xì)胞外泌體對(duì)創(chuàng)面愈合的影響,并通過miRNA測(cè)序,預(yù)測(cè)關(guān)鍵信號(hào)分子,最終從外泌體角度揭示導(dǎo)致糖尿病創(chuàng)面不愈合的分子機(jī)制。

方法:將30只150g左右SD大鼠編號(hào),之后按照隨機(jī)數(shù)表隨機(jī)分為實(shí)驗(yàn)組和對(duì)照組,實(shí)驗(yàn)組大鼠注射55 mg/kg鏈脲佐菌素檸檬酸鹽緩沖液,對(duì)照組注射等量檸檬酸鹽緩沖液。7天后測(cè)量大鼠體重、血糖、飲水量和尿量,以血糖大于16.7mmol/L,體重較對(duì)照組明顯減輕,飲水量和尿量較對(duì)照組顯著增多為建模成功指標(biāo),持續(xù)建模12周后用于實(shí)驗(yàn)。用組織貼壁法分別提取實(shí)驗(yàn)組及對(duì)照組大鼠背部皮膚的成纖維細(xì)胞,傳代培養(yǎng)細(xì)胞至P3代。用不含外泌體的血清與DMEM配置成完全培養(yǎng)基,培養(yǎng)P3代大鼠成纖維細(xì)胞,并收集細(xì)胞上清。將收集的細(xì)胞上清用超濾管濃縮后,裝入超速離心管,差數(shù)離心提取外泌體,并將獲得的外泌體做電鏡、納米顆粒跟蹤分析技術(shù)(NTA)、western-blot檢測(cè)鑒定。用CCK-8檢測(cè)糖尿病大鼠來源成纖維細(xì)胞外泌體(Diabetes Exosome)較RAT1大鼠成纖維細(xì)胞系外泌體(Normal Exosome)對(duì)人角質(zhì)形成細(xì)胞系(HEK-a)和人微血管內(nèi)皮細(xì)胞系(HMEC-1)細(xì)胞增值的影響。

建立大鼠背部全層皮膚創(chuàng)面模型,觀察糖尿病大鼠來源成纖維細(xì)胞外泌體和正常大鼠來源成纖維細(xì)胞外泌體較PBS對(duì)照組,對(duì)大鼠創(chuàng)面愈合的影響。分別提取糖尿病大鼠來源和RAT1大鼠成纖維細(xì)胞系外泌體總RNA,進(jìn)行miRNA測(cè)序。然后,對(duì)已知miRNA進(jìn)行差異表達(dá)分析,并預(yù)測(cè)所得差異miRNA的靶基因信息。根據(jù)預(yù)測(cè)結(jié)果對(duì)靶基因進(jìn)行功能注釋及富集分析。結(jié)果:糖尿病誘導(dǎo)的大鼠中,有10只符合建模成功的標(biāo)準(zhǔn)。實(shí)驗(yàn)組的大鼠,體重較對(duì)照組顯著減少,血糖值、每日飲水量和尿量較對(duì)照組顯著增高。提取的成纖維細(xì)胞原代呈細(xì)長(zhǎng)梭形,胞漿透亮豐富。外泌體透射電鏡可見典型的外泌體雙層膜結(jié)構(gòu)。NTA提示所得外泌體直徑在50-200nm,符合要求。外泌體western-blot提示,測(cè)得外泌體陽性指標(biāo)熱休克蛋白90(HSP90)、熱休克蛋白70(HSP70)較細(xì)胞對(duì)照組增高,外泌體陰性指標(biāo)GM130、β-tubulin未測(cè)得。CCK-8檢測(cè),加入Diabetes Exosome及Normal Exosome后,HEK-a和HMEC-1在450nm處吸光度較對(duì)照組均有顯著增高。

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