背景^[1-3]

大鼠視網(wǎng)膜色素上皮細(xì)胞是一種常用的實(shí)驗(yàn)細(xì)胞，用于研究視網(wǎng)膜色素上皮細(xì)胞具有支持、營(yíng)養(yǎng)光感受器細(xì)胞、遮光、散熱以及再生和修復(fù)等作用。胞的生理和病理過程。這些細(xì)胞具有支持、營(yíng)養(yǎng)光感受器細(xì)胞、遮光、散熱以及再生和修復(fù)等作用。

在組織學(xué)上，視網(wǎng)膜分為10層，由外向內(nèi)分別是：色素上皮層、視桿細(xì)胞層、視錐細(xì)胞層、外界膜、外核層、內(nèi)界膜、內(nèi)核層、神經(jīng)節(jié)細(xì)胞層、神經(jīng)纖維層和內(nèi)界膜。其中，色素上皮層與脈絡(luò)膜緊密相連，由色素上皮細(xì)胞組成。

RPEC大鼠視網(wǎng)膜色素上皮細(xì)胞通常以T25培養(yǎng)瓶包裝，容積75ml細(xì)胞數(shù)量可達(dá)10的6次方左右。這些細(xì)胞生長(zhǎng)特性良好，活性高，存活率高，質(zhì)量保證，沒有細(xì)菌、真菌、支原體等微生物污染。

大鼠視網(wǎng)膜色素上皮細(xì)胞

大鼠視網(wǎng)膜色素上皮細(xì)胞培養(yǎng)操作

1)復(fù)蘇大鼠視網(wǎng)膜色素上皮細(xì)胞：以下細(xì)胞培養(yǎng)凍存處理僅供參考，具體操作步驟以隨貨產(chǎn)品說明書為主。

將含有1 mL細(xì)胞懸液的凍存管在37℃水浴中迅速搖晃解凍，加4 mL培養(yǎng)基混合均勻。在1000 rpm條件下離心3 min，棄去上清液，加1-2 mL培養(yǎng)基后吹勻。然后將所有細(xì)胞懸液加入含適量培養(yǎng)基的培養(yǎng)瓶中培養(yǎng)過夜（或?qū)⒓?xì)胞懸液加入10 cm皿中，加入約8 mL培養(yǎng)基，培養(yǎng)過夜）。第二天換液并檢查細(xì)胞密度。

2)大鼠視網(wǎng)膜色素上皮細(xì)胞傳代：如果細(xì)胞密度達(dá)80%-90%，即可進(jìn)行傳代培養(yǎng)。

a、棄去培養(yǎng)上清，用不含鈣、鎂離子的PBS潤(rùn)洗細(xì)胞1-2次。

b、加1 mL消化液（0.25%Trypsin-0.53mM EDTA）于培養(yǎng)瓶中，使消化液浸潤(rùn)所有細(xì)胞，棄去消化液，將培養(yǎng)瓶置于37℃培養(yǎng)箱中消化1 min，然后在顯微鏡下觀察細(xì)胞消化情況，若細(xì)胞大部分變圓并脫落，迅速拿回操作臺(tái)，輕敲幾下培養(yǎng)瓶后加少量培養(yǎng)基終止消化。

c、按6-8 mL/瓶補(bǔ)加培養(yǎng)基，輕輕打勻后裝入無菌離心管中，1000 rpm離心4 min，棄去上清液，補(bǔ)加1-2 mL培養(yǎng)液后吹勻。

d、將細(xì)胞懸液按1:2比例分到新的含8 mL培養(yǎng)基的新皿中或者瓶中，置于培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。

3)大鼠視網(wǎng)膜色素上皮細(xì)胞凍存：待細(xì)胞生長(zhǎng)狀態(tài)良好時(shí)，可進(jìn)行細(xì)胞凍存。下面T25瓶為例；

a、收集細(xì)胞及細(xì)胞培養(yǎng)液，裝入無菌離心管中，1000 rpm條件下離心4 min，棄去上清液，用PBS清洗一遍，棄盡PBS，進(jìn)行細(xì)胞計(jì)數(shù)。

b、根據(jù)細(xì)胞數(shù)量加入無血清細(xì)胞凍存液，使細(xì)胞密度5×106~1×107/mL，輕輕混勻，每支凍存管凍存1mL細(xì)胞懸液，注意凍存管做好標(biāo)識(shí)。

c、將凍存管放入-80℃冰箱，24 h后轉(zhuǎn)入液氮灌儲(chǔ)存。記錄凍存管位置以便下次拿取。

應(yīng)用^[4-5]

大鼠視網(wǎng)膜色素上皮細(xì)胞可以用于八肽膽囊收縮素對(duì)高糖所致大鼠視網(wǎng)膜色素上皮細(xì)胞損傷的干預(yù)作用

應(yīng)用不同濃度的八肽膽囊收縮素（Cholecystokinin octapeptide，CCK-8)作用于高糖培養(yǎng)的大鼠視網(wǎng)膜色素上皮細(xì)胞，培養(yǎng)48小時(shí)后，MTT法檢測(cè)細(xì)胞活力以及NRF2、SOD1、γ-GCS、NQO1、TNF-α、IL-1α、及IL-6的表達(dá)的變化，根據(jù)結(jié)果篩選出CCK-8合適的治療濃度，觀察此濃度作用RPE細(xì)胞24小時(shí)、48小時(shí)及72小時(shí)上述因子的表達(dá)變化。

方法：1篩選CCK-8治療濃度：培養(yǎng)大鼠視網(wǎng)膜色素上皮細(xì)胞，取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期細(xì)胞進(jìn)行實(shí)驗(yàn)，隨機(jī)分為8組：①正常對(duì)照組（葡萄糖濃度：5.56mmol/L）②高糖組（葡萄糖濃度：30mmol/L）③高滲對(duì)照組（葡萄糖濃度：5.56mmol/L+甘露醇：24.44mmol/L）④高糖+CCK-8治療組（葡萄糖濃度：30mmol/L+CCK-8濃度：10-5mmol/L）⑤高糖+CCK-8治療組（葡萄糖濃度：30mmol/L+CCK-8濃度：10-6mmol/L）⑥高糖+CCK-8治療組（葡萄糖濃度：30mmol/L+CCK-8濃度：10-7mmol/L）⑦高糖+CCK-8治療組（葡萄糖濃度：30mmol/L+CCK-8濃度：10-8mmol/L）⑧高糖+CCK-8治療組（葡萄糖濃度：30mmol/L+CCK-8濃度：10-9mmol/L），各組細(xì)胞應(yīng)用同種培養(yǎng)液培養(yǎng)24小時(shí)后換成條件培養(yǎng)液，繼續(xù)培養(yǎng)48小時(shí)，倒置顯微鏡下觀察大鼠視網(wǎng)膜色素上皮細(xì)胞形態(tài)，應(yīng)用MTT法檢測(cè)不同濃度CCK-8對(duì)大鼠視網(wǎng)膜色素上皮細(xì)胞活力的影響，同時(shí)收集細(xì)胞標(biāo)本，進(jìn)行RT-PCR實(shí)驗(yàn)，檢測(cè)NRF2、SOD1、γ-GCS、NQO1、TNF-α、IL-1α、IL-6表達(dá)的變化。

2不同時(shí)間段CCK-8治療濃度10-6mmol/L相關(guān)因子變化：根據(jù)MTT及RT-PCR的結(jié)果得出CCK-8的治療濃度為10-6mmol/L，再次分組：①正常對(duì)照組（葡萄糖濃度：5.56mmol/L）②高糖組(葡萄糖濃度：30mmol/L)③高滲對(duì)照組(葡萄糖濃度：5.56mmol/L+甘露醇：24.44mmol/L)④高糖+CCK-8治療組（葡萄糖濃度：30mmol/L+CCK-8濃度：10-6mmol/L），各組細(xì)胞分別培養(yǎng)24小時(shí)、48小時(shí)、72小時(shí)，取相應(yīng)時(shí)間段細(xì)胞標(biāo)本進(jìn)行RT-PCR檢測(cè)上述7種因子表達(dá)。

結(jié)果：1MTT法檢測(cè)結(jié)果：與正常對(duì)照組比較，高糖組大鼠視網(wǎng)膜色素上皮細(xì)胞的活力明顯降低（P<0.05），高滲對(duì)照組細(xì)胞活力未見明顯改變；各不同濃度治療組的細(xì)胞活力低于正常對(duì)照組，具有明顯差異（P<0.05），CCK-8濃度為10-7mmol/L、10-8mmol/L、10-9mmol/L三組之間細(xì)胞活力無明顯差異，三組與高糖組相比無明顯差異，CCK-8濃度為10-6mmol/L與10-5mmol/L兩組之間細(xì)胞活力無明顯差異，但要高于其他三組治療組和高糖組（P<0.05）。

2篩選CCK-8治療濃度階段RT-PCR結(jié)果：與正常對(duì)照組比較，高糖組NRF2、SOD1、γ-GCS、NQO1、TNF-α、IL-1α、IL-6的表達(dá)上升（P<0.05），高滲對(duì)照組的表達(dá)未見明顯差異。各不同濃度治療組與正常對(duì)照組相比，其中NRF2、SOD1、γ-GCS及NQO1的表達(dá)明顯上升（P<0.05），TNF-α、IL-1α及IL-6的表達(dá)明顯下降（P<0.05）。與高糖組相比，CCK-8濃度為10-7mmol/L、10-8mmol/L、10-9mmol/L三組中NRF2、SOD1、γ-GCS及NQO1的表達(dá)上升（P<0.05），TNF-α、IL-1α及IL-6的表達(dá)下降（P<0.05），但是三組之間未見明顯差異。CCK-8濃度為10-6mmol/L與10-5mmol/L兩組之間未見明顯差異，但與其他三組治療組及高糖組相比，NRF2、SOD1、γ-GCS及NQO1的表達(dá)明顯上升（P<0.05），TNF-α、IL-1α及IL-6的表達(dá)明顯下降（P<0.05）。

3不同時(shí)間段CCK-8治療濃度10-6mmol/L相關(guān)因子變化：與正常對(duì)照組相比，高滲對(duì)照組7因子的表達(dá)未見明顯差異；高糖組與正常對(duì)照組及高滲對(duì)照組相比，上述7種因子的表達(dá)明顯上升（P<0.05）；與高糖組相比，治療組NRF2、SOD1、γ-GCS及NQO1表達(dá)明顯上升（P<0.05），48小時(shí)高于24小時(shí)及72小時(shí)（P<0.05），24小時(shí)及72小時(shí)之間無明顯差異；與高糖組相比，治療組TNF-α、IL-1α及IL-6表達(dá)下降（P<0.05），72小時(shí)的表達(dá)低于24小時(shí)和48小時(shí)（P<0.05），24小時(shí)和48小時(shí)間的表達(dá)無明顯差異。

參考文獻(xiàn)

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[2]How does the macula protect itself from oxidative stress?.James T.Handa.Molecular Aspects of Medicine,2012

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