背景^[1-3]

MUTZ-3急性非淋巴白血病懸浮細(xì)胞系是一種人類(lèi)急性非淋巴白血病的細(xì)胞系，它是由一名患有急性髓系白血病的患者中分離出來(lái)的。這種細(xì)胞系在腫瘤學(xué)研究中具有重要價(jià)值，因?yàn)樗梢杂糜谠u(píng)估新的治療方法和藥物的有效性，以及研究急性髓系白血病的發(fā)生和發(fā)展機(jī)制。

MUTZ-3急性非淋巴白血病懸浮細(xì)胞系通常被用于體外實(shí)驗(yàn)?zāi)Ｐ?，例如?xì)胞培養(yǎng)、基因轉(zhuǎn)染、蛋白質(zhì)表達(dá)等技術(shù)。研究人員可以通過(guò)改變培養(yǎng)條件、添加生長(zhǎng)因子或使用基因編輯技術(shù)來(lái)改變MUTZ-3細(xì)胞系的行為，以更好地模擬體內(nèi)環(huán)境并提高治療效果。此外，MUTZ-3細(xì)胞系還可以用于研究腫瘤微環(huán)境對(duì)腫瘤生長(zhǎng)和轉(zhuǎn)移的影響。

MUTZ-3急性非淋巴白血病懸浮細(xì)胞系

MUTZ-3急性非淋巴白血病懸浮細(xì)胞系培養(yǎng)操作

1)復(fù)蘇MUTZ-3急性非淋巴白血病懸浮細(xì)胞系：以下細(xì)胞培養(yǎng)凍存處理僅供參考，具體操作步驟以隨貨產(chǎn)品說(shuō)明書(shū)為主。

將含有1mL細(xì)胞懸液的凍存管在37℃水浴中迅速搖晃解凍，加入4mL培養(yǎng)基混合均勻。在1000RPM條件下離心4分鐘，棄去上清液，補(bǔ)加1-2mL培養(yǎng)基后吹勻。然后將所有細(xì)胞懸液加入培養(yǎng)瓶中培養(yǎng)過(guò)夜（或?qū)⒓?xì)胞懸液加入10cm皿中，加入約8ml培養(yǎng)基，培養(yǎng)過(guò)夜）。第二天換液并檢查細(xì)胞密度。

2)MUTZ-3急性非淋巴白血病懸浮細(xì)胞系傳代：如果細(xì)胞密度達(dá)80%-90%，即可進(jìn)行傳代培養(yǎng)。

a、棄去培養(yǎng)上清，用不含鈣、鎂離子的PBS潤(rùn)洗細(xì)胞1-2次。

b、加1ml消化液（0.25%Trypsin-0.53mM EDTA）于培養(yǎng)瓶中，置于37℃培養(yǎng)箱中消化1-2分鐘，然后在顯微鏡下觀察細(xì)胞消化情況，若細(xì)胞大部分變圓并脫落，迅速拿回操作臺(tái)，輕敲幾下培養(yǎng)瓶后加少量培養(yǎng)基終止消化。

c、按6-8ml/瓶補(bǔ)加培養(yǎng)基，輕輕打勻后吸出，在1000RPM條件下離心4分鐘，棄去上清液，補(bǔ)加1-2mL培養(yǎng)液后吹勻。

d、將細(xì)胞懸液按1：2比例分到新的含8ml培養(yǎng)基的新皿中或者瓶中。

3)MUTZ-3急性非淋巴白血病懸浮細(xì)胞系凍存：待細(xì)胞生長(zhǎng)狀態(tài)良好時(shí)，可進(jìn)行細(xì)胞凍存。下面T25瓶為例；

a、收集細(xì)胞及細(xì)胞培養(yǎng)液，裝入無(wú)菌離心管中，1000 rpm條件下離心4 min，棄去上清液，用PBS清洗一遍，棄盡PBS，進(jìn)行細(xì)胞計(jì)數(shù)。

b、根據(jù)細(xì)胞數(shù)量加入無(wú)血清細(xì)胞凍存液，使細(xì)胞密度5×106~1×107/mL，輕輕混勻，每支凍存管凍存1mL細(xì)胞懸液，注意凍存管做好標(biāo)識(shí)。

c、將凍存管放入-80℃冰箱，24 h后轉(zhuǎn)入液氮灌儲(chǔ)存。記錄凍存管位置以便下次拿取。

應(yīng)用^[4-5]

MUTZ-3急性非淋巴白血病懸浮細(xì)胞系可以用于CLEC12A在急性髓系白血病中的表達(dá)特征、免疫調(diào)節(jié)作用及預(yù)后價(jià)值

急性髓系白血病(Acute myeloid leukemia,AML)是以髓系干/祖細(xì)胞異常自我增殖為特征的造血系統(tǒng)惡性腫瘤,是成人最常見(jiàn)的急性白血病類(lèi)型。過(guò)去十幾年間,AML發(fā)病率不斷增加,但生存率并無(wú)明顯改善。AML的治療仍然依賴于聯(lián)合化療、自體或異體造血干細(xì)胞移植(HSCT)等。對(duì)于不適合強(qiáng)誘導(dǎo)化療的AML老年患者,目前缺乏有效的治療手段。

驗(yàn)證CLEC12A在AML LSCs中的表達(dá)特異性,探討CLEC12A表達(dá)與AML臨床病理特征和實(shí)驗(yàn)室指標(biāo)的相關(guān)性及預(yù)后價(jià)值,進(jìn)一步明確CLEC12A在AML中的潛在生物學(xué)功能病理機(jī)制,研究CLEC12A作為CAR-T細(xì)胞治療靶點(diǎn)在AML中的作用,為AML的診斷、免疫治療及預(yù)后提供理論依據(jù)。

研究方法1.驗(yàn)證CLEC12A在AML LSCs中的表達(dá)特異性:利用多種公共數(shù)據(jù)庫(kù)和臨床標(biāo)本比較CLEC12A在各種類(lèi)型腫瘤和細(xì)胞系中的表達(dá)差異,比較CLEC12A在正常HSCs和AML LSCs的表達(dá)差異,驗(yàn)證CLEC12A在AML LSCs中的表達(dá)特異性。

2. 分析CLEC12A表達(dá)與AML臨床病理特征和實(shí)驗(yàn)室指標(biāo)的相關(guān)性及預(yù)后價(jià)值:基于155名非M3初診AML患者臨床信息如年齡、性別、突變基因、細(xì)胞遺傳學(xué)、分子生物學(xué)、實(shí)驗(yàn)室指標(biāo)、隨訪期是否復(fù)發(fā)及隨訪期末是否生存等,分析CLEC12A表達(dá)與AML臨床病理特征和實(shí)驗(yàn)室指標(biāo)的相關(guān)性及生存分析。構(gòu)建cox回歸模型評(píng)估CLEC12A在AML患者中的獨(dú)立預(yù)后價(jià)值。

3. 探討CLEC12A在AML中的潛在生物學(xué)功能及病理機(jī)制:篩選CLEC12A高/低表達(dá)組差異表達(dá)基因,通過(guò)GO/KEGG富集分析及蛋白互作網(wǎng)絡(luò)分析明確CLEC12A在AML中可能參與的生物學(xué)相關(guān)通路。

4. CLEC12A免疫相關(guān)分析:分析CLEC12A表達(dá)與10種免疫細(xì)胞浸潤(rùn)水平及免疫檢查點(diǎn)基因的相關(guān)性,預(yù)測(cè)CLEC12A高/低表達(dá)組患者對(duì)ICB治療的響應(yīng)性差異。

研究結(jié)果1.CLEC12A在AML中表達(dá)顯著上調(diào)。CLEC12A在AML樣本及AML細(xì)胞系P31/FUJ、PL-21、AML-193和MUTZ-3急性非淋巴白血病懸浮細(xì)胞系中表達(dá)顯著上調(diào)。CLEC12A在LSCs中顯著高表達(dá),而在正常造血干細(xì)胞不表達(dá)。

2. CLEC12A在AML中的預(yù)后價(jià)值。CLEC12A表達(dá)與WBC計(jì)數(shù)、FAB分類(lèi)和細(xì)胞遺傳學(xué)風(fēng)險(xiǎn)分層顯著相關(guān)。CLEC12A低表達(dá)組IDH1,TP53,和TET2基因突變頻率顯著增高,但RUNX1基因突變頻率顯著降低。CLEC12A低表達(dá)提示預(yù)后不良。CLEC12A低表達(dá)是60歲以下并在緩解誘導(dǎo)期間接受強(qiáng)化治療的非M3型AML患者的獨(dú)立預(yù)后風(fēng)險(xiǎn)因素。

3. CLEC12A在AML中發(fā)揮重要的免疫調(diào)節(jié)作用。CLEC12A通過(guò)多種與免疫相關(guān)的通路參與AML多環(huán)節(jié)病理生理功能。CLEC12A高表達(dá)與M2巨噬細(xì)胞和單核細(xì)胞浸潤(rùn)呈正相關(guān),與NK細(xì)胞和Tregs浸潤(rùn)呈負(fù)相關(guān)。CLEC12A高表達(dá)與CD47,HAVCR2,SIGLEC15,SIRPA和PDCD1LG2正相關(guān),與PDCD1,TIGIT和LAG3呈負(fù)相關(guān)。CLEC12A高表達(dá)預(yù)示著對(duì)免疫檢查點(diǎn)阻斷治療(ICB)療效更好。

結(jié)論：在AML中,CLEC12A在LSCs中表達(dá)顯著增高,可能是CAR-T細(xì)胞療法的理想靶點(diǎn)。CLEC12A可作為AML一個(gè)新的預(yù)后生物標(biāo)志物,補(bǔ)充目前AML預(yù)后風(fēng)險(xiǎn)分層系統(tǒng),并發(fā)揮重要免疫調(diào)節(jié)作用。

參考文獻(xiàn)

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