背景[1-3]
兔骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞(BMSC)是一種存在于兔骨髓基質(zhì)系統(tǒng)中的干細(xì)胞,具有高度自我更新能力和多向分化潛能。這種干細(xì)胞可以向骨、軟骨、肌組織、皮膚、脂肪、神經(jīng)等多種組織分化,因此可以作為組織工程中的種子細(xì)胞。
兔骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞的分離和體外培養(yǎng)要求較高的條件,如貼壁時(shí)間、種植密度、血清含量、培養(yǎng)溫度和培養(yǎng)基pH值等。在普諾賽實(shí)驗(yàn)室,采用沖洗骨髓、密度梯度離心、差速貼壁法結(jié)合培養(yǎng)基篩選的方法,可以獲得兔骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞,細(xì)胞總量約為5×10?cells/瓶。
兔骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞的純度可以通過(guò)CD90免疫熒光鑒定達(dá)到90%以上,并且不含有HIV-1、HBV、HCV、支原體、細(xì)菌、酵母和真菌等。這種干細(xì)胞的保存和培養(yǎng)需要在特定的培養(yǎng)條件下進(jìn)行,如培養(yǎng)溫度保持在37℃,使用含有10%胎牛血清的DMEM培養(yǎng)基等。
兔骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞(BMSC)
兔骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞處理:
1)凍存細(xì)胞的復(fù)蘇:
將含有1mL細(xì)胞懸液的凍存管在37℃水浴中迅速搖晃解凍,加入到含4-6mL完全培養(yǎng)基的離心管中混合均勻。在1000RPM條件下離心3-5min,棄去上清液,完全培養(yǎng)基重懸細(xì)胞。然后將細(xì)胞懸液加入含6-8ml完全培養(yǎng)基的培養(yǎng)瓶(或皿)中37℃培養(yǎng)過(guò)夜。第二天顯微鏡下觀察細(xì)胞生長(zhǎng)情況和細(xì)胞密度。
2)兔骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞傳代:如果細(xì)胞密度達(dá)80%-90%,即可進(jìn)行傳代培養(yǎng)。
對(duì)于貼壁細(xì)胞傳代可以參考以下方法:
1.棄去培養(yǎng)上清,用不含鈣、鎂離子的PBS潤(rùn)洗細(xì)胞1-2次。
2.加入0.25%(w/v)胰蛋白酶-0.53 mM EDTA于培養(yǎng)瓶中(T25瓶1-2mL,T75瓶2-3mL),置于37℃培養(yǎng)箱中消化1-2分鐘(難消化的細(xì)胞可以適當(dāng)延長(zhǎng)消化時(shí)間),然后在顯微鏡下觀察細(xì)胞消化情況,若細(xì)胞大部分變圓并脫落,迅速拿回操作臺(tái),輕敲幾下培養(yǎng)瓶后加入3-4ml含10%FBS的培養(yǎng)基來(lái)終止消化。
3.輕輕打勻后吸出,在1000RPM條件下離心3-5min,棄去上清液,補(bǔ)加1-2mL培養(yǎng)液后吹勻。將細(xì)胞懸液按1:2的比例分到新T25瓶中,添加6-8ml按照說(shuō)明書(shū)要求配置的新的完全培養(yǎng)基以保持細(xì)胞的生長(zhǎng)活力,后續(xù)傳代根據(jù)實(shí)際情況按1:2~1:5的比例進(jìn)行。
3)兔骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞凍存:收到細(xì)胞后建議在培養(yǎng)前3代時(shí)凍存一批細(xì)胞種子以備后續(xù)實(shí)驗(yàn)使用。
下面T25瓶為例;
1.細(xì)胞凍存時(shí)按照細(xì)胞傳代的過(guò)程收集消化好的細(xì)胞到離心管中,可使用血球計(jì)數(shù)板計(jì)數(shù),來(lái)決定細(xì)胞的凍存密度。一般細(xì)胞的推薦凍存密度為1×106~1×107個(gè)活細(xì)胞/ml.
2.1000rpm離心3-5min,去掉上清。用配制好的細(xì)胞凍存液重懸細(xì)胞,按每1ml凍存液含1×106~1×107個(gè)活細(xì)胞/ml分配到一個(gè)凍存管中將細(xì)胞分配到凍存管中,標(biāo)注好名稱(chēng)、代數(shù)、日期等信息。
3.將要凍存的細(xì)胞置于程序降溫盒中,-80度冰箱中過(guò)夜,之后轉(zhuǎn)入液氮容器中儲(chǔ)存。同時(shí)記錄好凍存管在液氮容器中的位置以便后續(xù)查閱和使用。
應(yīng)用[4][5]
兔骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞可以用于兔骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞體外構(gòu)建血管化組織工程心肌的實(shí)驗(yàn)研究
利用兔骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞作為種子細(xì)胞,分別誘導(dǎo)為心肌樣細(xì)胞和內(nèi)皮細(xì)胞,于體外構(gòu)建血管化組織工程心肌組織,為臨床上通過(guò)組織工程與細(xì)胞移植技術(shù)治療心肌梗死這一疾病提供理論基礎(chǔ)和技術(shù)支持。
方法1選取普通級(jí)日本大耳白兔,無(wú)菌分離雙側(cè)股骨及脛骨,采用Percoll分離液分離兔骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞并使用流式細(xì)胞儀鑒定其表面標(biāo)志物CD90、CD105和CD45。使用內(nèi)皮細(xì)胞條件培養(yǎng)基(Endothelial cell culture medium,ECM)對(duì)兔骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞誘導(dǎo)為內(nèi)皮細(xì)胞,采用免疫細(xì)胞化學(xué)染色的方法對(duì)表面標(biāo)志物CD34和CD31進(jìn)行鑒定。顯微鏡下觀察兔骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞和內(nèi)皮細(xì)胞的形態(tài)學(xué)變化。
2使用5-氮胞苷對(duì)兔骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞定向誘導(dǎo)為心肌樣細(xì)胞,免疫細(xì)胞化學(xué)染色的方法對(duì)表面標(biāo)志物心肌肌鈣蛋白T(Cardiac troponin T,c TNT)進(jìn)行鑒定,并于顯微鏡下觀察誘導(dǎo)后細(xì)胞的形態(tài)學(xué)變化。
3分別使用4,6-二氨基-2-苯基吲哚(4,6-diamino-2-phenylindole,DAPI)和氯甲基苯甲酰氨(Chloromethylbenzamidodialkylcarbocyanine,CM-DIL)標(biāo)記心肌樣細(xì)胞和內(nèi)皮細(xì)胞。
4將誘導(dǎo)后獲得的心肌樣細(xì)胞與內(nèi)皮細(xì)胞按照不同比例進(jìn)行共培養(yǎng)(1∶0、0∶1、1∶1、1∶2)。
5將不同組的細(xì)胞接種至Matrigel基質(zhì)膠和膠原海綿兩種支架材料上,觀察細(xì)胞-支架材料復(fù)合物的血管化形成能力。
6采用SPSS 23.0統(tǒng)計(jì)軟件對(duì)實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析,計(jì)量資料使用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差(sx±)的形式表示,多個(gè)樣本的均數(shù)之間的比較采用單因素方差分析,以P<0.05表示具有顯著性差異。采用Graph Pad Prism 8.0軟件進(jìn)行圖形的繪制。
結(jié)果1通過(guò)流式細(xì)胞儀技術(shù)檢測(cè)可觀察到使用Percoll分離液的方法可獲得兔骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞,CD90和CD105表面標(biāo)志物呈現(xiàn)為陽(yáng)性表達(dá),CD45為陰性表達(dá),顯微鏡下可觀察到48小時(shí)的兔骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞形態(tài)為透亮圓形、折光性較強(qiáng),第1代的兔骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞,細(xì)胞長(zhǎng)短伸展不一,形態(tài)多為短梭形,內(nèi)含少量雜質(zhì)細(xì)胞,第2代的兔骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞,細(xì)胞呈現(xiàn)為梭形,第3代的兔骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞,細(xì)胞體積較起始細(xì)胞體積大,形態(tài)變?yōu)殚L(zhǎng)梭形,多邊形。
參考文獻(xiàn)
[1]Electroactive graphene composite scaffolds for cardiac tissue engineering.Pamela Hitscherich;;Ashish Aphale;;Richard Gordan;;Ricardo Whitaker;;Prabhakar Singh;;Lai‐hua Xie;;Prabir Patra;;Eun Jung Lee.Journal of Biomedical Materials Research Part A,2018
[2]Different Sources of Stem Cells and their Application in Cartilage Tissue Engineering.Quanquan Ma;;Jinfeng Liao;;Xiaoxiao Cai.Current Stem Cell Research&Therapy,2018
[3]Transplantation of CREG modified embryonic stem cells improves cardiac function after myocardial infarction in mice.Jian Zhang;;Xiaoxiang Tian;;Chengfei Peng;;Chenghui Yan;;Yang Li;;Mingyu Sun;;Jian Kang;;Erhe Gao;;Yaling Han.Biochemical and Biophysical Research Communicatio,2018
[4]Advances in osteobiologic materials for bone substitutes.Anwarul Hasan;;Batzaya Byambaa;;Mahboob Morshed;;Mohammad Ibrahim Cheikh;;Rana Abdul Shakoor;;Tanvir Mustafy;;Hany E.Marei.Journal of Tissue Engineering and Regenerative Me,2018
[5]韓劉君.兔骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞體外構(gòu)建血管化組織工程心肌的實(shí)驗(yàn)研究[D].華北理工大學(xué),2021.