背景[1-3]
SDS-PAGE凝膠快速配制試劑盒采用上層膠和下層膠的預(yù)混配方，只需加入10%APS即可凝膠，簡(jiǎn)便快捷。下層膠與上層膠可連續(xù)灌注，時(shí)間節(jié)省一半以上。所配的上層膠可以帶有紅色，使得電泳孔清晰易辯利于上樣，該指示劑電泳結(jié)束時(shí)跑在最前端，既能監(jiān)控電泳過(guò)程，也能在轉(zhuǎn)印過(guò)程轉(zhuǎn)移到膜上，監(jiān)測(cè)轉(zhuǎn)移效率。本試劑盒灌制的凝膠也可用于非變性PAGE凝膠電泳。本產(chǎn)品配套提供改良型促凝劑，其具有更好的穩(wěn)定性和催化效能，配膠過(guò)程中無(wú)需額外添加TEMED。
SDS-PAGE凝膠快速配制試劑盒
SDS-PAGE凝膠快速配制試劑盒使用說(shuō)明：
以下按制備一塊0.75mm|1.00mm|1.5mm的mini膠為例，多塊膠按比例放大體積，也可以多配一些備用。
1.取等體積的Separating Gel Buffer(2×)與Separating Gel Solution(2×)各2ml|2.8ml|4ml于合適的容器中，混勻。
2.取1ml|1.5ml|2ml 5%Stacking Gel Solution于合適的容器中。
注意：如果需要，可以加入2μl|3μl|4μl染料，混勻。此染料能讓上樣孔易辯，電泳時(shí)會(huì)跑在最前沿，監(jiān)測(cè)電泳過(guò)程，電轉(zhuǎn)時(shí)也能轉(zhuǎn)印到膜上，監(jiān)測(cè)電轉(zhuǎn)效果。在15%膠濃度時(shí)，此染料遷移速率比溴酚藍(lán)慢。
3.向步驟1的分離膠混合液中加入40μl|60μl|80μl 10%APS Solution，混勻。
4.用1ml移液器迅速將上述分離膠灌入制膠槽中，直到合適的液面高度為止。（液面距短玻板邊沿約1.5cm）
5.向步驟2的濃縮膠混合液中加入10μl|15μl|20μl 10%APS Solution，混勻。
6.用1ml移液器立即（分離膠未凝固）將上述濃縮膠沿著玻板緩慢加入制膠槽中，灌滿為止，插入梳子，室溫聚合15-30min.凝固后，即可拔去梳子，加樣進(jìn)行電泳。
注意：為了使分離膠與濃縮膠分層效果更好，灌濃縮膠時(shí)，用1ml的移液器邊灌膠，邊從玻板的一端慢慢地移動(dòng)到另一端。也可在插入梳子后，輕輕地稍微抬起濃縮膠液面較淺的一端，再緩慢放下，以幫助濃縮膠平衡，從而使得界面平整。一般情況下無(wú)需操作，界面都很平整。
應(yīng)用[4][5]
SDS-PAGE凝膠快速配制試劑盒可以用于基于包涵體的重組抗菌肽表達(dá)研究
研究以Metchnikowin(Metch)和MagininⅡ(MagⅡ)作為目的抗菌肽,選取易于形成包涵體的綠色熒光蛋白(GFP)、棕櫚酰磷脂轉(zhuǎn)移酶(PagP)和組蛋白折疊結(jié)構(gòu)域(TAF)作為融合標(biāo)簽,構(gòu)建系列融合蛋白(融合標(biāo)簽與抗菌多肽之間依次插入Ni2+切割的識(shí)別位點(diǎn)、His6-tag純化標(biāo)簽及蛋白酶TEV識(shí)別位點(diǎn))(融合標(biāo)簽-NHT-AMPs)及相應(yīng)的表達(dá)載體。
利用大腸桿菌表達(dá)獲取包涵體,經(jīng)過(guò)SDS-PAGE、灰度分析和Western Blot檢測(cè),三種融合標(biāo)簽相比,PagP有利于獲得較高的抗菌肽表達(dá)量,其與抗菌肽融合表達(dá)的條件為表達(dá)時(shí)間10 h、誘導(dǎo)物IPTG濃度為0.5 mM。
將包涵體溶解于6 M鹽酸胍的Hepes buffer(pH8.2)中,進(jìn)行融合蛋白的Ni2+化學(xué)裂解。為進(jìn)一步研究Ni2+化學(xué)裂解的條件,本研究探索了反應(yīng)時(shí)間、溫度和融合蛋白濃度三個(gè)因素對(duì)Ni2+化學(xué)裂解效率的影響,結(jié)果顯示在60℃、融合蛋白為200μM的條件下反應(yīng)24 h,Ni2+可有效裂解融合蛋白,形成融合標(biāo)簽PagP與短肽HT-AMPs?；瘜W(xué)裂解后的融合標(biāo)簽可通過(guò)相應(yīng)的緩沖液進(jìn)行稀釋沉淀,而短肽HT-AMPs經(jīng)Ni-NTA得到進(jìn)一步純化,純化后的短肽HT-AMPs經(jīng)TEV蛋白酶酶切后得到完整的抗菌肽。
本研究還對(duì)抗菌肽的活性進(jìn)行了測(cè)定,抑菌實(shí)驗(yàn)顯示,HT-MagⅡ(HT-Metch)經(jīng)TEV酶切后不具有生物學(xué)活性,可能由于咪唑、高濃度鹽的影響,除鹽后均表現(xiàn)出抑菌活性,MagⅡ能殺死大腸桿菌MG 1655和金黃色葡萄球菌,表現(xiàn)出對(duì)革蘭氏陽(yáng)性菌與陰性菌的雙向抗性;Metch能殺死枯草芽孢桿菌和藤黃微球菌表現(xiàn)出革蘭氏陽(yáng)性菌抗性。
參考文獻(xiàn)
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[2]Combining a PagP fusion protein system with nickel ion-catalyzed cleavage to produce intrinsically disordered proteins in E.coli.Somaya Zahran;;Jonathan S.Pan;;Philip B.Liu;;Peter M.Hwang.Protein Expression and Purification,2015
[3]Targeted expression,purification,and cleavage of fusion proteins from inclusion bodies in Escherichia coli.Peter M.Hwang;;Jonathan S.Pan;;Brian D.Sykes.FEBS Letters,2014
[4]A PagP fusion protein system for the expression of intrinsically disordered proteins in Escherichia coli.Peter M.Hwang;;Jonathan S.Pan;;Brian D.Sykes.Protein Expression and Purification,2012
[5]陳長(zhǎng)超.基于包涵體的重組抗菌肽表達(dá)研究[D].華南農(nóng)業(yè)大學(xué),2016.