背景技術
γ-癸內酯(gamma decalactone),簡稱GDL,是一種帶有桃香味的內酯類香味物質。它是一個含有五元內酯環(huán)的十碳化合物,為無色液體,分子式為C10H18O2,分子量為170.25,微溶于水,易溶于有機溶劑,被廣泛用于配制奶油、桃子、柑橘和椰子等型香精中,是香料中需求較大的產品之一。隨著γ-癸內酯在香料香精行業(yè)的廣泛應用,很多香料公司將興趣投向了這一潛在市場并開始進行研發(fā),使得γ-癸內酯的生物轉化生產有了快速發(fā)展,天然γ-癸內酯的售價也由20000美元/kg降至1000美元/kg( 2014年)。
以蓖麻油酸為底物,利用發(fā)酵法制備γ-癸內酯的生產工藝,目前存在的問題是:由于蓖麻油酸具有難溶于水的特性,其在水中的分散性較差,這就導致蓖麻油酸分子在水相介質中向酵母細胞內進行轉運的過程受到極大限制,酵母與底物接觸不充分,致使酵母對底物的利用率降低,最終嚴重影響γ-癸內酯的生成速率和產量。據目前相關文獻及專利報道,為了解決上述發(fā)酵過程中存在的問題,一般采用兩種方式來解決:(1)向發(fā)酵液中添加表面活性劑,以增強底物在水相中的分散性,而表面活性劑的加入雖然有利于底物在水相中的分散,提升底物向細胞內的運輸速率,但其不利于細胞的正常生長,甚至高濃度的表面活性劑還會抑制酵母細胞活性,使γ-癸內酯的產量不能得到較大提升;(2)向發(fā)酵液中添加高濃度蓖麻油酸進行生物轉化。高濃度蓖麻油酸的添加有助于增加水相中底物的有效濃度,一定時期內可提升γ-癸內酯的生成量,但水相中過高濃度的蓖麻油酸對酵母細胞具有較為明顯的抑制作用,不利于酵母細胞活性的維持,使最終γ-癸內酯的總產量沒有較大提升,同時較大量的底物添加量增加了γ-癸內酯生產的一次性投入成本,不利于產品的工業(yè)放大。
因此,建立一種生物毒性低及生物相容性好并且對底物分散性具有積極促進作用的轉化體系,用于γ-癸內酯的生物轉化,成為目前該產品向產業(yè)化發(fā)展的必然趨勢。
發(fā)明內容
針對現有技術中的上述技術問題,本發(fā)明提供一種天然香料γ-癸內酯的制備方法,所述的這種γ-癸內酯的制備方法要解決現有技術中的方法制備γ-癸內酯的生成速率和產量低的技術問題。
本發(fā)明提供了一種天然香料γ-癸內酯的制備方法,包括如下步驟:
1)一個對改性纖維材料進行處理的步驟,先用粉碎機將改性纖維粉碎,然后利用20、50、80或者120目的篩子對改性纖維進行篩選;
2)一個制備包埋物的步驟,將步驟1)中篩選出的改性纖維與蓖麻油酸按質量比1:0.5-2混合,在30℃-60℃的溫度下水浴0.5-1.5h,并持續(xù)攪拌,獲得包埋物;
3)一個制備轉化培養(yǎng)基的步驟,所述的轉化培養(yǎng)基由七水硫酸鎂、磷酸氫二鉀、甘油、L-肉堿和水組成,在所述的轉化培養(yǎng)基中,七水硫酸鎂的濃度為7-14g/L,磷酸氫二鉀的濃度為7-14g/L,甘油的濃度為8-18g/L,L-肉堿的濃度為0.08-0.2g/L,所述的轉化培養(yǎng)基的pH為6.0-6.8;
4)一個加入包埋物的步驟,將步驟2)的包埋物按照45-150g/L的量加入到上述步驟(3)的轉化培養(yǎng)基中,加入后使得蓖麻油酸的濃度為30-50g/L;
5)一個滅菌的步驟,將上述步驟4)中含有包埋物的轉化培養(yǎng)基于115~130℃的溫度下濕熱滅菌15min;
6)一個接菌的步驟,將高活性酵母粉加入到步驟5)的物料中,菌種接種量為10-20g/L;
7)一個轉化培養(yǎng)的步驟,轉化培養(yǎng)過程中的搖瓶條件為:轉速為200-300r/min,溫度為22-33℃,轉化50-90h;轉化培養(yǎng)過程中的發(fā)酵罐條件為:轉速為300-600r/min,溫度為22-33℃,轉化50-90h,通氣量3.0-6.0v ? v-1? m-1,發(fā)酵結束后獲得γ-癸內酯。
進一步的,所述改性纖維是一種對油脂具有較強吸附能力并對酵母細胞無毒害作用的天然來源纖維。
進一步的,所述改性纖維是經過粉碎后篩選出20-120目范圍內的用于包埋蓖麻油酸的改性纖維顆粒。
進一步的,所述的高活性的酵母粉為市售安琪高糖型高活性干酵母。
本發(fā)明提供了一種提高底物分散性且進一步提高γ-癸內酯產量的方法,本發(fā)明通過將底物蓖麻油酸包埋進入改性纖維,再利用包埋物進行γ-癸內酯生產。所述方法中所采用的包埋物(改性纖維-蓖麻油酸)具有兩個優(yōu)點:(1)提高底物在水中的分散性;(2)對底物具有緩釋作用,降低高濃度底物對細胞的抑制作用。
本發(fā)明是一種通過將蓖麻油酸與打碎的不同粒徑的纖維顆?;旌显谝黄疬M行包埋處理,通過酵母生物轉化蓖麻油酸制備天然香料γ-癸內酯的方法。改性纖維主要包括纖維素醚類、纖維素酯類和改性纖維素的接枝共聚物。同時纖維表面布滿一些納米級和微米級的小孔,具有很強的吸附能力和簡單的脫附能力。本發(fā)明所使用的改性纖維(購自上海古陽實業(yè)有限公司,型號:GY131)是一種經過改性處理的纖維材料,所以當改性纖維在吸附蓖麻油酸飽和以后,再投入發(fā)酵液,一是對底物起到了一定的分散作用,使酵母細胞更有利于吸附到油滴表面;二是改性纖維會對蓖麻油酸具有一種緩釋作用,同時也降低了底物對于細胞的抑制作用。
本發(fā)明是以一定粒徑大小的改性纖維和蓖麻油酸形成的包埋物為底物,利用高活性酵母發(fā)酵制備天然γ-癸內酯。實驗結果表明,經過改性纖維包埋的實驗組γ-癸內酯產量可達8.2g/L,比對照組5.1g/L提高了60.7%。本發(fā)明提供的方法相比常規(guī)油水兩相的發(fā)酵體系具有以下優(yōu)勢:(1)有助于提升產物生成速率;(2)縮短發(fā)酵周期;(3)能夠緩解底物蓖麻油酸對酵母細胞的抑制作用,使細胞活性能夠達到較好的狀態(tài),從而較大地提高了γ-癸內酯的一次積累量。
本發(fā)明與已有技術相比,其技術進步是顯著的。本發(fā)明能夠打破常規(guī)的油水兩相的發(fā)酵體系,提升了產物生成速率,縮短了發(fā)酵周期,更重要的是能夠緩解底物蓖麻油酸對酵母細胞的抑制作用,從而較大地提高了γ-癸內酯的一次積累量,具有良好的工業(yè)應用前景。
具體實施方式
為使本發(fā)明實施例的目的、技術方案和優(yōu)點更加清楚,下面將對本發(fā)明實施例的技術方案進行清楚、完整地描述。本發(fā)明的實施例首先提供一種天然香料γ-癸內酯的制備方法的對照實施例,包括如下步驟:
配制轉化培養(yǎng)基:蓖麻油酸40g/L,七水硫酸鎂10g/L,磷酸氫二鉀10g/L,甘油15g/L,L-肉堿0.12g/L,pH為6.4,將培養(yǎng)基裝入250ml搖瓶中,裝液量50ml;滅菌:121℃,濕熱滅菌15min;接菌:滅完菌待冷卻后,依據酵母粉15g/L,在無菌條件下稱取高活性酵母粉(購自安琪酵母股份有限公司,型號:食品級)0.75g,并接入搖瓶中;轉化培養(yǎng):搖瓶放入恒溫搖床,轉化條件為:轉速250r/min,溫度28℃,轉化時間60h,得到含有γ-癸內酯的發(fā)酵液;檢測:按搖瓶中發(fā)酵液的體積的三倍加入無水乙醇,充分震蕩搖勻,取樣處理進行氣相色譜法檢測,得到發(fā)酵液中γ-癸內酯的含量。測得60h時發(fā)酵液中γ-癸內酯的含量為3.5g/L。