背景^[1-3]

SDS-PAGE凝膠配制試劑盒把SDS-PAGE凝膠配制所需的Tris-HCl、Acr-Bis（29:1）、SDS等預混合成上、下層膠預混液，使用前僅需加入適量促凝成分和TEMED即可在1 h內(nèi)完成下層膠（分離膠）和上層膠（濃縮膠）的配制。其中上層濃縮膠帶有淡紅色，點樣孔清晰易辨，便于上樣。極大程度上簡化了凝膠制備的操作流程，降低了實驗人員接觸劇毒試劑的機率，具有快速、方便、安全、穩(wěn)定等特點。

SDS-PAGE凝膠配制試劑盒

SDS-PAGE凝膠配制試劑盒約可配制50塊（mini型1 mm）大小的12%SDS-PAGE凝膠（蛋白樣品的分離范圍為12-60 kD）。具體可以配制的凝膠數(shù)量和凝膠的厚薄、大小以及操作手法有關(guān)。

SDS-PAGE凝膠配制試劑盒操作步驟：

根據(jù)目的蛋白分子量大小選擇合適的PAGE分離膠配制濃度。

灌制分離膠

1.參照凝膠模具說明書，裝配好凝膠模具。注：加入上層篩板有助于加樣時保持填料與樣品均勻接觸，是否加入上層篩板可根據(jù)實際情況選擇。

2.將不同體積的30%Acr-Bis(29:1)、SDS-PAGE Separating Gel Buffer、SDS Buffer和純水在小燒杯或試管中混合。

3.加入10%APS和TEMED，輕輕攪拌使其混勻，避免產(chǎn)生氣泡。

4.在凝膠模具中灌入適量分離膠溶液（對于mini-gel，凝膠液加至約距前玻璃板頂端1.5 cm或距梳齒約0.5 cm即可），然后在分離膠溶液上輕輕覆蓋一層1 cm的水層，使凝膠表面保持平整。

5.靜置30-60分鐘，待分離膠和水層之間出現(xiàn)一個清晰的界面后，表面凝膠已聚合。

II灌制濃縮膠

1.去除覆蓋在分離膠上的水層。

2.將不同體積的30%Acr-Bis(29:1)、SDS-PAGE Stacking Gel Buffer、SDS Buffer和純水在一個小燒杯或試管中混合。

3.加入10%APS和TEMED，輕輕攪拌使其混勻，避免產(chǎn)生氣泡。

4.將濃縮膠溶液加至分離膠的上面，直至凝膠溶液到達前玻璃板的頂端。

5.將梳子插入凝膠內(nèi)，避免產(chǎn)生氣泡。

6.靜置10~20分鐘，等待濃縮膠聚合。

7.待凝膠聚合后，小心地拔出梳子，以免破壞加樣孔。

8.進行常規(guī)電泳操作。

應用^[4][5]

SDS-PAGE凝膠配制試劑盒可以用于手足口病毒雞卵黃抗體的制備及抗病毒作用研究

通過制備抗腸道病毒71型雞卵黃抗體(anti-EV71 IgY),開展其在體內(nèi)及體外抗腸道病毒71型(EV71),體外抗柯薩奇病毒A16型(CVA16)的相關(guān)檢測,并對其抗EV71和CVA16的作用機制進行探討。以期探索出一種新的能交叉被動免疫治療由EV71和CVA16引發(fā)的手足口病(HFMD)方案。

方法:以EV71毒株作為抗原,與弗氏不完全佐劑1:1混合并吹打使其乳化均勻,通過多次注射來免疫SPF級母雞,收集并提取純化IgY;蛋白定量法檢測IgY的總蛋白濃度;通過聚丙烯酰胺凝膠電泳(SDS-PAGE)測試IgY純度;采用間接酶聯(lián)免疫吸附法(ELISA)來評價特異性IgY的濃度變化規(guī)律;蛋白質(zhì)印記法和免疫雙向瓊脂擴散法檢測純化IgY的特異性;采用觀測人橫紋肌肉瘤細胞(RD)的細胞病變效應(CPE)檢測特異性IgY體外對EV71與CVA16中和能力的量效關(guān)系,抗EV71穩(wěn)定性和時效性;通過免疫熒光法檢測特異性IgY在非洲綠猴腎細胞(Vero)中的抗EV71作用;灌胃給藥檢測特異性IgY對被EV71病毒感染的新生BALB/c鼠的保護作用。

結(jié)果:IgY總蛋白濃度在免疫后整體呈上升趨勢;SDS-PAGE電泳圖顯示純化的IgY純度良好,可被分裂為分子量約為70 kDa的IgY重鏈(H)及30 kDa的IgY輕鏈(L);通過ELISA我們發(fā)現(xiàn)特異性IgY濃度在免疫后的第7天出現(xiàn)增加,在第7周達到最高,并在較高水平維持4周左右;免疫雙向瓊脂擴散實驗與Western blot測得特異性IgY具有與EV71、CVA16毒株良好的免疫結(jié)合性,能特異性識別EV71和CVA16的包膜蛋白VP1及VP3;IgY體外中和病毒實驗結(jié)果顯示,特異性IgY能抑制EV71病毒和CVA16病毒的感染病變能力,并呈劑量-效應相關(guān)關(guān)系,差異具有統(tǒng)計學意義;特異性IgY在感染早期對EV71病毒有很強的抑制作用,感染后期抑制效果不明顯;特異性IgY在4℃、室溫、37℃條件下48 h后抗病毒活性依然穩(wěn)定,60℃條件下1.6μg/mL仍能對病毒達到100%的抑制率。反復凍融5次后對IgY的抗病毒活性沒有影響。

特異性IgY對腸道病毒EV71、CVA16有很強的抑制活性,對其他腸道病毒抑制效果不明顯;免疫熒光法顯示特異性IgY在3.72μg/mL對Vero細胞中的毒株能達到近乎100%的抑制作用;特異性IgY實驗組新生鼠生存率達到100%,相比于對照組無消瘦,精神萎靡,毛發(fā)生長異常等癥狀。

結(jié)論:(1)免疫后提取的特異性IgY純度與抗病毒特異性良好。

(2) 特異性IgY能識別EV71、CVA16病毒的包膜蛋白VP1與VP3,在體外抗病毒實驗中能有效地抑制EV71病毒和CVA16病毒活性并呈劑量-效應相關(guān)關(guān)系。

(3) 特異性IgY作用于EV71感染早期處理明顯優(yōu)于后期,并且特異性IgY的穩(wěn)定性較好。

(4)特異性IgY灌胃給藥后可以對被EV71攻擊的乳鼠提供保護。

參考文獻

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