牛腸激酶輕鏈簡介[1]
腸激酶（Enterokinase,EK）是存在于哺乳動物十二指腸內的一種異源二聚體絲氨酸蛋白酶。在 pH 值（4.5～9.5）、溫度 4～45℃范圍內專一識別 Asp-Asp-Asp-Asp-Lys，并水解 Lys 后肽鍵。由于經 EK 裂解融合蛋白所釋放的目的多肽具有和野生型完全一致的N 末端氨基酸序列，因而可作為蛋白表達體系中融合蛋白的切割試劑。但是天然的腸激酶來源有限，價格昂貴，并且提取分離的成本高，加之天然提取的腸激酶易被其它蛋白酶污染，在切割融合蛋白的同時可能又降解了目的產物，運用基因工程方法可以彌補這些不足。
牛腸激酶輕鏈生理特點[1]
1939 年 Kunitz證實腸激酶是胰蛋白酶原的生理激活劑，而胰蛋白酶是消化系統(tǒng)其它許多酶原的激活劑，因此腸激酶被認為是消化系統(tǒng)重要的起始酶之一。一般認為EK 存在于小腸刷狀緣細胞膜上，Zamolodchikova等認為 pro-EK 是由十二指腸酶激活的。病理研究發(fā)現(xiàn)，十二指腸與胰腺的回流液中富集 EK 會激活過多的胰蛋白酶原從而導致急性胰腺炎，而 EK 缺陷的機體將會有腹瀉、嘔吐、浮腫等癥狀，造成發(fā)育不良，導致血蛋白不足癥和貧血。
重組牛腸激酶輕鏈在大腸桿菌中的表達和純化[2]
經過密碼子優(yōu)化全基因合成了牛腸激酶輕鏈基因,采用pET-39b(+)構建了融合表達載體,為有效純化和回收目標蛋白,在sBEKLC的C末端添加了his標簽.在大腸桿菌中進行成功表達,產量達到151.2 mg/L DsbA-sBEKLC,相當于80.6 mg/LsBEKLC.高表達的DsbA-sBEKLC融合蛋白雖然沒有生物活性,但可用于復性來得到活性sBEKLC.使用滲透沖擊技術從細胞周質中提取蛋白,經過親和層析可從每升發(fā)酵液中得到6.8 mgsBEKLC,sBEKLC經檢測具有生物活性,為重組腸激酶在融合蛋白純化中的應用提供了可靠的物質基礎.
參考文獻
[1] 牛腸激酶輕基因的克隆及其在大腸桿菌中的融合表達的研究
[2]重組牛腸激酶輕鏈在大腸桿菌中的表達和純化.黃磊