一、研究背景

乳腺癌是女性中最常見(jiàn)的癌癥，在與癌癥相關(guān)的女性死亡病例中，乳腺癌造成的死亡人數(shù)最多(約15%)，雖然化療是治療多種癌癥的主要策略，但化療耐藥使乳腺癌患者化療的總體有效率仍不高，這種耐藥的一個(gè)主要機(jī)制是抗凋亡系統(tǒng)的激活，使癌細(xì)胞逃避藥物誘導(dǎo)的凋亡，所以急需引入可觸發(fā)非凋亡PCD的新型藥物。三氯苯達(dá)唑20多年來(lái)一直用于治療家畜肝吸蟲(chóng)感染，并成功地用于治療人類吸蟲(chóng)病，目前尚無(wú)關(guān)于其抗癌作用及可能機(jī)制的研究報(bào)道。在本研究中，以表達(dá)GSDME蛋白的乳腺癌MCF-7和MDA-MB-231細(xì)胞株為細(xì)胞模型，通過(guò)激活caspase-3誘導(dǎo)GSDME依賴性焦亡來(lái)探討三氯苯達(dá)唑?qū)δ[瘤的作用。

二、結(jié)果分析

1、三氯苯達(dá)唑通過(guò)降低線粒體膜電位誘導(dǎo)乳腺癌細(xì)胞焦亡

CCK-8結(jié)果顯示160μM三氯苯達(dá)唑能顯著降低乳腺癌細(xì)胞的細(xì)胞活性，V-FITC/PI染色后檢測(cè)到細(xì)胞雙陽(yáng)性比例上升，PI單陽(yáng)性細(xì)胞比例上升，且經(jīng)藥物處理后細(xì)胞呈圓形、腫脹，胞質(zhì)膜外有明顯的大泡延伸，以上指標(biāo)表明三氯苯達(dá)唑可誘導(dǎo)乳腺癌細(xì)胞發(fā)生焦亡。作者進(jìn)一步探討三氯苯達(dá)唑是否通過(guò)干擾線粒體功能而誘導(dǎo)乳腺癌細(xì)胞焦亡，結(jié)果發(fā)現(xiàn)該藥物顯著降低了JC-1聚集物(紅色)與單體(綠色)的比例，表明這兩種細(xì)胞在三氯苯達(dá)唑治療后膜電位降低。

2、凋亡通路介導(dǎo)三氯苯達(dá)唑誘導(dǎo)乳腺癌細(xì)胞焦亡

為進(jìn)一步研究三氯苯達(dá)唑誘導(dǎo)乳腺癌細(xì)胞焦亡的機(jī)制，作者檢測(cè)了凋亡的蛋白標(biāo)記物，包括Bax、Bcl-2、cleaved-caspase-9、cleaved-caspase-8、cleaved-caspase-3、cleaved caspase-7和cleaved-PARP，結(jié)果顯示Bax的表達(dá)上調(diào)，Bcl-2表達(dá)下調(diào)，凋亡啟動(dòng)因子caspase-8和caspase-9在三氯苯達(dá)唑處理的細(xì)胞中以劑量依賴的方式被激活和切割，下游caspase-3、caspase-7也被激活，PARP被裂解激活。上述結(jié)果表明，細(xì)胞凋亡的內(nèi)在途徑和外在途徑均被啟動(dòng)，最終焦亡執(zhí)行蛋白GSDME在caspase-3的剪切下活化，于細(xì)胞膜上寡聚打孔。

3、Cleaved-Caspase-3是三氯苯達(dá)唑誘導(dǎo)乳腺癌細(xì)胞焦亡的關(guān)鍵開(kāi)關(guān)

因?yàn)閏leaved caspase-3是將GSDME加工成N-GSDME (37KD)片段的關(guān)鍵酶，作者接下來(lái)探討了阻斷caspase-3的激活是否會(huì)減弱三氯苯達(dá)唑誘導(dǎo)的細(xì)胞死亡，在使用caspase-3的特異性抑制劑DEVD后，三氯苯達(dá)唑誘導(dǎo)的乳腺癌細(xì)胞死亡率下降，cleaved-caspase-3 (17/19 kDa), cleaved-GSDME (37 kDa), and cleaved-PARP (89 kDa) 表達(dá)均下調(diào)。這些結(jié)果表明，caspase-3介導(dǎo)的GSDME切割參與了三氯苯達(dá)唑誘導(dǎo)的細(xì)胞焦亡，并且N-GSDME水平與焦亡水平相關(guān)。

4、三氯苯達(dá)唑誘導(dǎo)的GSDME依賴性焦亡是ROS/JNK/ bax 線粒體凋亡通路的下游

經(jīng)三氯苯達(dá)唑處理后，MCF-7和MDA-MB- 231細(xì)胞株中ROS水平均上調(diào)，JNK的磷酸化顯著增加，但沒(méi)有改變JNK的組成性表達(dá)。在使用ROS清除劑NAC預(yù)處理后，NAC顯著抑制三氯苯達(dá)唑誘導(dǎo)的ROS升高，且NAC預(yù)處理可部分拮抗三氯苯達(dá)唑?qū)ax、Bcl-2表達(dá)和JNK磷酸化水平的影響，且提升了細(xì)胞存活率和線粒體膜電位，抑制了caspase-3、caspase-9、PARP、GSDME的裂解活化。這些結(jié)果表明，三氯苯達(dá)唑至少部分通過(guò)增強(qiáng)ROS/JNK/ bax 線粒體凋亡通路誘導(dǎo)焦亡。

5、三氯苯達(dá)唑誘導(dǎo)乳腺癌腫瘤移植物發(fā)生焦亡

將MDA-MB-231乳腺癌細(xì)胞植入BALB/C裸鼠右側(cè)翼皮下，并注射三氯苯達(dá)唑溶液，發(fā)現(xiàn)與對(duì)照組相比，三氯苯達(dá)唑顯著降低了腫瘤移植物的體積，cleaved-caspase-3，cleaved-PARP，N-GSDME表達(dá)上調(diào)，該結(jié)果與體外實(shí)驗(yàn)結(jié)果一致，表明三氯苯達(dá)唑在體內(nèi)可誘導(dǎo)乳腺癌細(xì)胞發(fā)生焦亡。