背景[1-3]
細(xì)胞裂解液是一種在非變性條件下裂解細(xì)胞的裂解液,是一種相對溫和的細(xì)胞裂解液,適用于提取細(xì)胞可溶性蛋白。細(xì)胞裂解液裂解細(xì)胞獲得的裂解產(chǎn)物,可用于PAGE,蛋白印跡(Western Blot),免疫沉淀(immnolprecipitation,IP),免疫共沉淀(co-IP)和蛋白與多肽的分離純化。
細(xì)胞裂解液的主要成分為Tris、EDTA、蔗糖,如果實(shí)驗(yàn)需要,需另行自備PMSF等蛋白酶抑制劑。裂解蛋白產(chǎn)物,可以用生產(chǎn)的BCA蛋白濃度測定試劑盒測定蛋白濃度。
細(xì)胞裂解液
使用說明:
1.培養(yǎng)細(xì)胞
(1)取出細(xì)胞裂解液,待融化后,顛倒混勻數(shù)次,可適量分裝凍存。如果實(shí)驗(yàn)需要,按比例加入PMSF(使其最終濃度為1mM)或其他蛋白酶抑制劑,混勻,立即使用。
(2)貼壁細(xì)胞,去除培養(yǎng)液,用PBS、生理鹽水或無血清培養(yǎng)液洗2-3遍(如血清中的蛋白沒有干擾,也可以不洗)。按6孔板每孔加入100-200微升的比例加入裂解液。用槍吹打數(shù)下,使裂解液和細(xì)胞
充分接觸。通常裂解液接觸細(xì)胞數(shù)秒后細(xì)胞就會(huì)被裂解。
(3)懸浮細(xì)胞,收集培養(yǎng)細(xì)胞,離心去除培養(yǎng)液,用PBS、生理鹽水或無血清培養(yǎng)液洗2-3遍(如血清中的蛋白沒有干擾,也可以不洗),用手指把細(xì)胞用力彈散,按6孔板每孔細(xì)胞加入100-200微升的比例加入裂解液。如果細(xì)胞數(shù)量較大,應(yīng)按50-100萬細(xì)胞/管分裝或根據(jù)細(xì)胞數(shù)量按比例增加裂解液。
用手指輕彈管底以促進(jìn)裂解液和細(xì)胞充分接觸,裂解完全時(shí)應(yīng)無明顯的細(xì)胞顆粒。
(4)裂解物經(jīng)10,000-14,000g離心3-5分鐘,取上清,即可進(jìn)行后續(xù)的PAGE、Western、免疫沉淀和免疫共沉淀等操作。
(5)裂解液用量說明:通常6孔板每孔細(xì)胞加入100微升裂解液已經(jīng)足夠,但如果細(xì)胞密度非常高可以適當(dāng)加大裂解液的用量到150微升或200微升。
2.組織樣品
取Ep管,分別稱重標(biāo)記,把組織剪切成小塊裝入Ep管中,稱重。按每20毫克組織加100-200微升的比例加入裂解液(如裂解不完全,可以適當(dāng)增加裂解液的用量;如需要的蛋白樣品濃度較高,可以適當(dāng)減少裂解液的用量)。用手握式電動(dòng)組織細(xì)胞勻漿器勻漿約1分鐘或直至充分裂解。10,000-14,000g離心3-5分鐘,取上清,即可進(jìn)行后續(xù)的PAGE、Western、免疫沉淀和免疫共沉淀等操作。
如果組織樣品本身非常細(xì)小,如淋巴細(xì)胞,可直接加入裂解液裂解,通過振蕩(Vortex)以使樣品裂解完全。
應(yīng)用[4][5]
細(xì)胞裂解液可以用于人臍帶間充質(zhì)干細(xì)胞裂解液對食管癌EC9706細(xì)胞中uPA、MMP-2的影響研究
探索hUCMSCs裂解液對食管癌EC9706細(xì)胞中uPA、MMP-2的表達(dá)的影響。為進(jìn)一步研究抑制作用機(jī)理奠定理論基礎(chǔ)。為臨床應(yīng)用干細(xì)胞抑制食管癌腫瘤轉(zhuǎn)移的治療方法提供理論依據(jù)。
方法1.培養(yǎng)食管癌EC9706細(xì)胞；2.采用組織塊培養(yǎng)法培養(yǎng)hUCMSCs,待細(xì)胞傳至第3代后流式細(xì)胞儀檢測細(xì)胞表型；3.收集hUCMSCs,用反復(fù)凍融法制備hUCMSCs裂解液；4.各個(gè)組擁有相同數(shù)量的食管癌EC9706細(xì)胞,向每組加入不同數(shù)量的hUCMSCs裂解液,然后培養(yǎng)60h。使用Western-blot法檢測食管癌EC9706細(xì)胞中uPA、MMP-2的表達(dá)變化。結(jié)果食管癌細(xì)胞EC9706在倒置顯微鏡下觀察其呈多邊形,形態(tài)多樣,細(xì)胞核質(zhì)比較大,細(xì)胞核形態(tài)不規(guī)則,細(xì)胞群體排列不規(guī)則。hUCMSCs組織塊培養(yǎng)法原代培養(yǎng)7-12d后,顯微鏡下可見梭形或多角形成纖維細(xì)胞。隨后可以發(fā)現(xiàn)hUCMSCs呈成纖維狀,漩渦狀排列。
流式細(xì)胞儀分析第3代hUCMSCs可檢測到實(shí)驗(yàn)組各組細(xì)胞CD90、CD 166等MSCs標(biāo)志物高表達(dá),不表達(dá)造血細(xì)胞表面特異性標(biāo)志CD34、CD45。當(dāng)用hUCMSCs裂解液處理過食管癌EC9706細(xì)胞后,uPA在對照組中的表達(dá)為0.28075±0.00233,在1/2倍組中的表達(dá)為0.28790±0.00176,在1倍組中的表達(dá)為0.13782±0.00542,在2倍組中的表達(dá)為0.12465±0.01277。
MMP-2在對照組中的表達(dá)為0.27051±0.01956,在1/2倍組中的表達(dá)為0.26698±0.00231,在1倍組中的表達(dá)為0.13017±0.01529,在2倍組中的表達(dá)為0.11755±0.00982。當(dāng)加入hUCMSCs數(shù)小于食管癌細(xì)胞數(shù)的裂解液時(shí)uPA、MMP-2的表達(dá)變化不明顯(P>0.05),當(dāng)加入hUCMSCs數(shù)大于或等于食管癌細(xì)胞數(shù)的裂解液時(shí)uPA、MMP-2的表達(dá)顯著降低(P<0.05)。
參考文獻(xiàn)
[1]Enhancing the Migration Ability of Mesenchymal Stromal Cells by Targeting the SDF-1/CXCR4 Axis[J].Leah A.Marquez-Curtis;;Anna Janowska-Wieczorek;;Ulrich Kneser.BioMed Research International,2013
[2]Human mesenchymal stem cells(hMSCs)target osteosarcoma and promote its growth and pulmonary metastasis[J].Wen-ting Xu;;Zhen-yu Bian;;Qi-ming Fan;;Gang Li;;Ting-ting Tang.Cancer Letters,2009(1)
[3]Human mesenchymal stem cells from bone marrow express tumor endothelialand stromal markers[J].Rebecca Bagley;;William Weber;;Cecile Rouleau;;Min Yao;;Nakayuki Honma;;Shiro Kataoka;;Isao Ishida;;Bruce Roberts;;Beverly Teicher.International Journal of Oncology,2009(3)
[4]Interactions Between Human Mesenchymal Stem Cells and Natural Killer Cells[J].Panagiota A.Sotiropoulou;Sonia A.Perez;Angelos D.Gritzapis;Constantin N.Baxevanis;MichaelPapamichail.STEM CELLS,2009(1)
[5]閆國旗.人臍帶間充質(zhì)干細(xì)胞裂解液對食管癌EC9706細(xì)胞中uPA、MMP-2的影響[D].新鄉(xiāng)醫(yī)學(xué)院,2015.