背景^[1]

GAS產(chǎn)生的鏈球菌溶血素O(streptolysin O,Slo)能夠使細(xì)胞膜產(chǎn)生大的孔道,毒蛋白進(jìn)入細(xì)胞質(zhì),對細(xì)胞產(chǎn)生毒性作用,因此, Recombinant Streptolysin O被認(rèn)為是一種重要的外毒素。此外, Recombinant Streptolysin O具有極強的抗原性,感染化膿性鏈球菌后2~3周內(nèi),85%以上病人會產(chǎn)生Slo抗體,病愈后可持續(xù)數(shù)月甚至數(shù)年;并且在風(fēng)濕熱、強直性脊柱炎等疾病患者血清中也存在較高滴度Recombinant Streptolysin O抗體,血清中抗鏈球菌溶血素O(anti-streptolysin O,ASO)的測定可廣泛應(yīng)用于與鏈球菌感染有關(guān)的疾病如腎小球腎炎、猩紅熱、扁桃體炎、風(fēng)濕熱及鏈球菌感染后反應(yīng)性關(guān)節(jié)炎等的診斷中,制備有效的檢測患者血清中Slo抗體的Slo抗原,對于鑒別診斷鏈球菌感染相關(guān)疾病以及療效評價具有重要價值。

應(yīng)用^[1]

Recombinant Streptolysin O有廣泛的應(yīng)用前景,不僅可應(yīng)用于與鏈球菌感染有關(guān)疾病以及鏈球菌感染后反應(yīng)性關(guān)節(jié)炎等疾病血清中ASO的檢驗;還能利用它提高細(xì)胞膜通透性,將鏈球菌溶血素O溶液加入受體細(xì)胞中,給予一定的作用時間,即可達(dá)到通透效果。通過這種方法可使目的細(xì)胞抽提物的大分子蛋白質(zhì)和核苷酸克服細(xì)胞膜的生物屏障,進(jìn)入需要修復(fù)的受體細(xì)胞后可以發(fā)揮重編程作用,使受體細(xì)胞轉(zhuǎn)變?yōu)槟康募?xì)胞,這一策略為人造器官提供了新的種子細(xì)胞來源,為病損組織器官替代修復(fù)治療提供了新思路。此外Recombinant Streptolysin 蛋白還可用于鏈球菌感染引起的肺炎的輔助治療。目前,獲得Slo可從天然培養(yǎng)中分離以及重組表達(dá)獲得。天然培養(yǎng)分離是通過大規(guī)模培養(yǎng)化膿性鏈球菌獲得其代謝產(chǎn)物再分離獲得Recombinant Streptolysin O,該方法的優(yōu)點是得到的Slo為天然結(jié)構(gòu),但操作復(fù)雜且產(chǎn)量低。本研究結(jié)果為利用大腸桿菌表達(dá)系統(tǒng)大量獲得既具有溶血活性,又具有特異性免疫活性的小分子Slo抗原奠定了基礎(chǔ)。

Recombinant Streptolysin O的誘導(dǎo)表達(dá)^[2]

將構(gòu)建的基因工程菌接種到含氨芐青霉素的LB培養(yǎng)基中,37℃震蕩培養(yǎng)過夜后,轉(zhuǎn)接到新鮮LB培養(yǎng)基,37℃震蕩培養(yǎng)到OD600值0.5左右時加入終濃度為1mmol/L的IPTG,誘導(dǎo)4h后離心,收集菌體,進(jìn)行SDS-PAGE電泳鑒定。

Recombinant Streptolysin O的分離純化^[2]

采用參考文獻(xiàn)的方法,離心收集菌體,菌體洗滌3次,加大腸桿菌超聲破碎液重懸菌體,超聲處理破碎菌體,離心收集包涵體沉淀,2M的尿素洗滌沉淀,用變性液溶解包涵體沉淀。利用Ni-NTA瓊脂糖凝膠進(jìn)行親和純化,操作步驟按照康為公司的Ni-NTA瓊脂糖凝膠操說明書進(jìn)行,純化蛋白經(jīng)12%SDS-PAGE電泳鑒定。取純化蛋白變性溶液逐滴滴加到復(fù)性液中,滴加過程中不斷攪拌,稀釋20倍后置于4℃冰箱24h進(jìn)行復(fù)性,再利用Millipore超濾管濃縮蛋白溶液后備用。

參考文獻(xiàn)

[1] 化膿性鏈球菌溶血素O活性結(jié)構(gòu)重組蛋白的制備 楊思源 潘敬梅 

[2] Sun Hua,Zhang Zi-de.Expression and purification and of human hydrogen peroxidase in E.coli and identification of its biological activity.Journal of Jinan University,2014,35(2):187-191.