背景[1][2][3]
最早獲得Recombinant Protein A的方法是從金黃色葡萄球菌中直接純化獲得,然而這種方法存在一些問(wèn)題,例如Recombinant Protein A只占菌體總蛋白的,難以滿足大規(guī)模生產(chǎn)的需要,且金黃色葡萄球菌為致病菌,大規(guī)模生產(chǎn)危險(xiǎn)性較大。為避免這些問(wèn)題,人們開始轉(zhuǎn)向采用基因工程技術(shù)來(lái)生產(chǎn)Recombinant Protein A,尋求大規(guī)模生產(chǎn)蛋白安全可行的途徑。
Recombinant Protein A的研發(fā)起源于年代初期的歐美,美國(guó)的公司最早申請(qǐng)了關(guān)于的專利,首次成功將Recombinant Protein A的基因在大腸桿菌中克隆和表達(dá),次年,英國(guó)人和緊隨其后,也發(fā)表了相似的工作。目前的研發(fā)已經(jīng)有幾十年的歷史,產(chǎn)業(yè)化格局業(yè)已形成。美國(guó)公司是全球的從事研發(fā)和生產(chǎn)的專業(yè)公司,該公司有近年的生產(chǎn)歷史,在大腸桿菌表達(dá)系統(tǒng)的構(gòu)建、基因表達(dá)調(diào)控、高密度培養(yǎng)、分離純化口等方面均作了系統(tǒng)的研究,開發(fā)了相應(yīng)的技術(shù),并分別獲得了表達(dá)和純化的相關(guān)專利。
該公司現(xiàn)在有多種形式的產(chǎn)品出售,其中具有與天然蛋白完全相同的基因序列和相對(duì)分子量,純度大于。目前,全球已上市的單克隆抗體藥物中,有超過(guò)一半的純化都用到了公司生產(chǎn)的,其中公司生產(chǎn)的蛋白親和層析介質(zhì)就是采用了該公司的。我國(guó)臨床蛋白免疫吸附材料所用的也均為該公司產(chǎn)品,在臨床治療中表現(xiàn)出了很好的療效,而且副作用小。
同時(shí),利用基因工程技術(shù)生產(chǎn),還可以通過(guò)基因水平上的改造制備能夠耐受惡劣環(huán)境穩(wěn)定性高的衍生物。構(gòu)建并表達(dá)了多種含蛋白的融合蛋白,發(fā)現(xiàn)在端融合蛋白或一葡萄糖醛酸酶后,能夠提高其端對(duì)蛋白酶降解的耐受性,且這種融合并不影響蛋白的結(jié)合活性。等以蛋白的結(jié)構(gòu)域?yàn)榈孜铩?/p>
國(guó)內(nèi)生產(chǎn)Recombinant Protein A上存在的主要問(wèn)題是產(chǎn)品純度低,非特異性吸附大,對(duì)抗體的親和力不高,但生產(chǎn)的成本卻很高,導(dǎo)致售價(jià)比進(jìn)口同類產(chǎn)品還略高。產(chǎn)生這些問(wèn)題的主要原因是國(guó)內(nèi)在Recombinant Protein A的基因構(gòu)建、表達(dá)以及生產(chǎn)工藝等環(huán)節(jié)缺乏系統(tǒng)深入的研究,其中最關(guān)鍵的問(wèn)題之一就是純化工藝還有待提高。
His-Tag絡(luò)合作用
固定化金屬離子親合層析Immobilizedmetalionaffinitychromatography,IMAC),簡(jiǎn)稱金屬螯合親合層析,是一種新型的應(yīng)用于原核蛋白純化的技術(shù)。該方法通過(guò)蛋白質(zhì)表面的一些特殊的氨基酸,使之與金屬離子發(fā)生相互作用,從而對(duì)蛋白質(zhì)進(jìn)行親和純化。這些作用包括配價(jià)鍵結(jié)合、靜電吸附、共價(jià)鍵結(jié)合等,其中以6個(gè)組氨酸殘基組合的融合標(biāo)簽(His-Tag)在原核蛋白表達(dá)中的應(yīng)用最為顯著。
Recombinant Protein A,His-tag定義及意義[1][2][3]
重組蛋白A基因的核苷酸序列如下:
GAATTCATAT GGTGGTAGAC AACAAATTCA ACAAAGAACA ACAAAACGCG TTCTATGAGA TCTTACATTT ACCTAACTTA AACGAAGAAC AACGAAACGC CTTCATCCAA AGTTTAAAAG ATGACCCAAG CCAAAGCGCT AACCTTTTAG CAGAAGCTAA AAAGCTAAAT GATGCTCAGG CGCCGAAAGT AGACAACAAA TTCAACAAAG AACAACAAAA CGCGTTCTAT GAGATCTTAC ATTTACCTAA CTTAAACGAA GAACAACGAA ACGCCTTCAT CCAAAGTTTA AAAGATGACC CAAGCCAAAG CGCTAACCTT TTAGCAGAAG CTAAAAAGCT AAATGATGCT CAGGCGCCGA AAGTAGACAA CAAATTCAAC AAAGAACAAC AAAACGCGTT CTATGAGAC TTACATTTAC CTAACTTAAA CGAAGAACAA CGAAACGCCT TCATCCAAAG TTTAAAAGAT GACCCAAGCC AAAGCGCTAA CCTTTTAGCA GAAGCTAAAA AGCTAAATGA TGCTCAGGCG CCGAAAGTAG ACTAAGGATC C
His-tag 是重組蛋白表達(dá)最常用的標(biāo)簽,無(wú)論表達(dá)的蛋白是可溶的或者包涵體都可以用固定金屬離子親和層析(IMAC)純化。 金屬螯合親合層析,又稱固定化金屬離子親合層析(Immobilized metal ion affinity chromatography, IMAC),是近30年發(fā)展起來(lái)的一種新型分離技術(shù)。最早由Paroth等人提出。該方法利用蛋白質(zhì)表面的一些氨基酸,如組氨酸、色氨酸、半胱氨酸等能和金屬離子發(fā)生特殊的相互作用的原理,從而對(duì)蛋白質(zhì)加以分離。這些作用包括配價(jià)鍵結(jié)合、靜電吸附、共價(jià)鍵結(jié)合,其中以配價(jià)鍵結(jié)合為主,而且這其中又以6組氨酸標(biāo)簽(His-Tag)應(yīng)用最為廣泛。
以His-Tag純化標(biāo)簽結(jié)合金屬螯合親合層析,為重組蛋白質(zhì)的分離純化提供了一個(gè)有力的工具。由于金屬螯合親合層析具有配體簡(jiǎn)單、吸附量大、分離條件溫和、通用性強(qiáng)等特點(diǎn),上樣條件可選擇范圍廣,在高鹽、一定濃度的變性劑以及去垢劑的條件下,帶6His純化標(biāo)簽的蛋白質(zhì)都可以和親合填料特異性結(jié)合,逐漸成為分離純化蛋白質(zhì)等生物工程產(chǎn)品最有效的技術(shù)之一。
主要參考資料
[1] 林雪. 蛋白A的重組表達(dá)及重組菌的發(fā)酵過(guò)程優(yōu)化[D]. 2010.
[2] 梁振東. 重組蛋白A親和介質(zhì)的制備及性能和應(yīng)用研究[D]. 2015.
[3] 林樂(lè)懿. His-tag標(biāo)記的嗜熱菌來(lái)源L-脯氨酸脫氫酶的純化與性質(zhì)研究及生物感應(yīng)器構(gòu)建的研究[D]. 北京化工大學(xué), 2010.