背景及概述

通關(guān)藤M(fèi)arsdenia ten acissima(Roxb.)Wight et Arn.系蘿科(Asclepiadaceae)牛奶菜屬(MarsdeniaR. Brown)植物，又名通光藤、通光散、烏骨藤和下奶藤等。主產(chǎn)云南，始載于《滇南本草》，蘭茂謂:“奶漿藤又名通光藤，莖心有白奶漿流出，味苦、澀，性寒。主治通乳、利尿、清火”。藥理研究表明，通關(guān)藤除了具有平喘、免疫調(diào)節(jié)、戒毒等作用，還具有良好的抗癌活性，其水提取物制劑消癌平片及注射液已在臨床中應(yīng)用，是一種很有前途的抗癌藥物。通關(guān)藤富含C21甾體衍生物(主要是C21甾體的糖苷)和多糖，還含有少量生物堿及樹(shù)脂等，其中C21甾體糖苷是通關(guān)藤抗炎、抗腫瘤及抗生育活性的物質(zhì)基礎(chǔ)。

通關(guān)藤苷G提取與分離

方法一、

通關(guān)藤莖10kg，粉碎，加水煎煮2h，收集煎煮液，減壓濃縮至2L，用等量醋酸乙酯萃取4次，回收溶劑，得醋酸乙酯萃取物260g;水相用等量正丁醇萃取4次，回收溶劑，得正丁醇萃取物280g。醋酸乙酯提取物上硅膠柱色譜分離，以石油醚-丙酮(50∶1)開(kāi)始梯度洗脫，共得到A～L12個(gè)部分。E段上硅膠柱(200～300目)，分EA～EC3部分，EB繼續(xù)上硅膠柱(CHCl3-Me2CO)，分兩部分，EBA上SephadexLH-20得通關(guān)藤苷G[1]。

方法二、

藥材8公斤，用85％乙醇回流提取3次(4h，3h，3h)，提取液濃縮至無(wú)醇，用石油醚、乙酸乙酯、正丁醇依次萃取，得到石油醚部分浸膏55克，乙酸乙酯部分浸膏240克，正丁醇部分浸膏360克和水部分浸膏714克。乙酸乙酯部位浸膏采用硅膠柱層析，氯仿-甲醇系統(tǒng)梯度洗脫，洗脫流份再次經(jīng)硅膠柱層析、凝膠柱層析及反相柱層析分離得到通關(guān)藤苷G。

通關(guān)藤苷G含量測(cè)定

方法一、

色譜條件

色譜柱:SymmetryC18柱(250mm×4．6mm，5μm);流動(dòng)相:乙腈－0．1%磷酸溶液(55∶45，V/V);檢測(cè)波長(zhǎng):230nm;流速:1mL/min;柱溫:25℃;進(jìn)樣量:20μL。

溶液制備

供試品溶液:取消癌平片，去除糖衣，研細(xì)，取0．55g，精密稱定，置分液漏斗中，加入三氯甲烷6mL、水24mL，搖勻，靜置，取有機(jī)層，連續(xù)萃取3次，將所制得溶液蒸干，用甲醇復(fù)溶，并定容至10mL，經(jīng)0．22μm微膜濾過(guò)，取續(xù)濾液，即得。

對(duì)照品溶液:稱取通關(guān)藤苷G對(duì)照品13．4mg，精密稱定，置10mL容量瓶中，用甲醇溶解并定容，得通關(guān)藤苷G質(zhì)量濃度為1．34mg/mL的對(duì)照品溶液。

方法學(xué)考察

專屬性考察:取對(duì)照品溶液適量，用甲醇稀釋，制成通關(guān)藤苷G質(zhì)量濃度為67μg/mL的對(duì)照品溶液。按擬訂色譜條件進(jìn)樣對(duì)照品溶液、供試品溶液及陰性對(duì)照品(甲醇)溶液進(jìn)行分析，色譜圖見(jiàn)圖1。

1．通關(guān)藤苷G

A．對(duì)照品溶液B．供試品溶液

C．陰性對(duì)照品溶液

圖1高效液相色譜圖

線性關(guān)系考察:精密量取對(duì)照品溶液，用甲醇稀釋成系列質(zhì)量濃度(2，4，8，20，40，60，80，100μg/mL)的對(duì)照品溶液，按擬訂色譜條件進(jìn)樣分析，記錄色譜圖。以通關(guān)藤苷G色譜峰面積(Y)為縱坐標(biāo)、質(zhì)量濃度(X)為橫坐標(biāo)進(jìn)行線性回歸，得回歸方程Y=5×106X－6048，r=0．9995(n=8)。結(jié)果表明，通關(guān)藤苷G質(zhì)量濃度在2～100μg/mL范圍內(nèi)與峰面積線性關(guān)系良好。

精密度試驗(yàn):取對(duì)照品溶液適量，加甲醇制成通關(guān)藤苷G低、中、高質(zhì)量濃度(20．0，40．0，60．0μg/mL)的對(duì)照品溶液，各分別重復(fù)進(jìn)樣6次，記錄峰面積。結(jié)果的ＲSD分別為0．76%，1．71%，1．27%(n=6)，表明儀器精密度良好。

穩(wěn)定性試驗(yàn):室溫下取供試品(樣品批號(hào)為20150301)溶液，分別于0，1，3，6，9，12，24h時(shí)進(jìn)樣測(cè)定，記錄峰面積。結(jié)果的ＲSD為0．82%(n=7)，表明室溫下供試品溶液在24h內(nèi)穩(wěn)定。

重復(fù)性試驗(yàn):取同批(批號(hào)為20150301)樣品粉末，6份，按2．2項(xiàng)下方法制備供試品溶液，按擬訂色譜條件進(jìn)樣測(cè)定。結(jié)果的ＲSD為1．84%(n=6)，表明方法重復(fù)性良好。

方法二、

色譜條件：色譜柱為WatersSunFireC18(250mm×4.6mm，5μm)；流動(dòng)相為乙腈-0.1%磷酸溶液(45∶55)；流速1.0ml/min；檢測(cè)波長(zhǎng)為230nm；柱溫25℃；進(jìn)樣量20μl。

對(duì)照品溶液的制備：取通關(guān)藤苷G對(duì)照品14.02mg，精密稱定，置50ml量瓶中，加甲醇溶解并定容至刻度，制成每1ml含0.2804mg通關(guān)藤苷G的對(duì)照品貯備液，精密量取對(duì)照品貯備液2ml，置10ml量瓶中，加甲醇稀釋至刻度，即得。

供試品溶液的制備：取正交試驗(yàn)條件下的干浸膏適量，蒸干后研細(xì)，精密稱定，置于具塞錐形瓶中，精密加入甲醇25ml，稱定重量，超聲處理(功率700W，頻率40kHz)30min后取出，待冷卻后稱定重量，用甲醇補(bǔ)足減失的重量，搖勻，濾液過(guò)0.45μm微孔濾膜，即得。

陰性對(duì)照溶液：取缺通關(guān)藤的本品處方，得陰性對(duì)照溶液。

系統(tǒng)適用性試驗(yàn)：取對(duì)照品溶液、供試品溶液和陰性對(duì)照溶液各20μl進(jìn)樣，按色譜條件測(cè)定，結(jié)果通關(guān)藤苷G分離效果良好，其他成分對(duì)測(cè)定無(wú)干擾，專屬性較好。

線性范圍考察：精密吸取對(duì)照品儲(chǔ)備液 1、2、3、4、5、6 ml，分別置 10 ml量瓶中，加甲醇稀釋至刻度，搖勻，得系列對(duì)照品溶液，按色譜條件，測(cè)定峰面積。以通關(guān)藤苷 G 進(jìn)樣量(μg)為橫坐標(biāo)(X)，峰面積為縱坐標(biāo)(Y)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，進(jìn)行線性回歸，得回歸方程 Y＝84.665X－0.110 7，r＝0.999 6，結(jié)果表明通關(guān)藤苷 G 在 0.560 8～3.364 8 μg 范圍內(nèi)呈良好的線性關(guān)系。

精密度試驗(yàn)：精密吸取通關(guān)藤苷 G 對(duì)照品溶液，按色譜條件，連續(xù)進(jìn)樣 6 次，計(jì)算峰面積的 RSD 值為 0.53%，表明儀器精密度良好。

重復(fù)性試驗(yàn)：取同一批藥材，制備供試品 6 份，并測(cè)定峰面積，以通關(guān)藤苷 G 含量計(jì)算 RSD 為 0.98%，表明試驗(yàn)重復(fù)性良好。

參考文獻(xiàn)

[1] 陳紀(jì)軍，張壯鑫，張潤(rùn)珍等．裂冠牛奶菜的化學(xué)成分．云南植物研究，1990，12(1)：931．