概述【1】
羥基積雪草酸是積雪草中有效活性成分，研究表明其具有抗氧化、抗抑郁、抗菌、調節(jié)免疫等多種藥理活性功能，尤其是對腫瘤細胞具有顯著的抑制作用。
提取【1】
1. 將積雪草粉碎,用60-70v%乙醇溶液川流提取,將提取液過濾,濾液回收溶劑，再加40-50C水溶解,過濾,將濾渣溶于50-60v%乙醇溶液,得到粗提液。
2. 將粗提液上XAD-9人孔樹脂柱,用pH值為2-4的酸液洗脫,合并流川液和酸洗液。
3. 調節(jié)合并液pH值至中性,過濾,將濾液再次EXAD-3大孔樹脂柱,用體積濃度為30-40%的乙醇洗脫,薄層層析跟蹤檢測,收集含有積雪草酸成分的乙醇洗脫液;再刃體積濃，度為55-65%的乙醇洗脫，薄層，層析跟蹤檢測,收集含羥基積雪草酸的乙醇洗脫液,將羥基積雪草酸洗脫液回收乙醇,干燥,得到羥基積雪草酸。
步驟1中，體積濃度為60-70%的乙醇可充分溶解積雪草中的二萜類物質，包括三萜炎皂節(jié)和三萜酸炎物質。由于積雪草皂并的分子中往往結合有多數(shù)糖分子,羥基數(shù)日多,能表現(xiàn)出一定的親水性，但足親水性不強,微溶于水中，而二萜酸類極性較小，不能溶于水中。因此采用40-50℃溫水可幫助積雪草總皂節(jié)溶解,積雪卓三惦酸類物質不溶于熱水中，將濾液過濾,取濾渣溶于乙醇，達到去除積雪草總皂苷的日的。
XAD-9樹脂主耍吸附的是脂溶性成分，大分子極性強的物質，這些物質對樹脂的吸附性更強，大孔樹脂優(yōu)先吸附這些物質而很快達到飽和。XAD-9是極性大孔樹脂，與三萜酸類極性相差較大，無法有效吸附三萜酸類化合物，XAD-9樹脂平均孔徑較大，遠遠大于三萜酸類化合物，也無法起到物理截留三萜酸類化合物的作用，因此，三萜酸類化合物會隨著流出液流出。pH值為2-4的酸液洗脫可進一步將樹脂中吸附的少量三萜酸類化合物洗脫下來,避免三萜酸類化合物的吸附損失。
步驟2中,粗提液上柱速度為3-5BV/h。酸液的洗脫速度為1-2BV/h。
步驟3中，XAD-3型號大孔樹脂為非極性樹脂，平均孔徑為0.44um，比表面積256m2/g。該樹脂對三萜酸類化合物有很有的吸附性能，濾液的上柱速度為0.5-1BV/h,可將二帖酸炎化合物吸附完全。由于積雪草酸和羥基積雪草酸存在極性差異，采用體積濃度為30-40%的乙醇洗脫，可優(yōu)先洗脫積雪草酸。然后用體積濃度為55-65%的乙醇洗脫，可將剩下的羥基積雪草酸洗脫卜來。
與現(xiàn)有技術相比,本方法針對目標成分進行吸附和解吸附，提取的羥基積雪草酸收率高達90%以上，純度高達95.0%以上。
具體實施
1. 將積雪草粉碎，用60v%乙醇溶液回流提取,60v%乙醇的用量為積雪草重量的5倍，在40°C下回流提取1次，每次0.5h，將提取液過濾,濾液回收溶劑，再加40°C水溶解，過濾，將濾渣溶于50v%乙醇溶液，得到粗提液。
2. 將粗提液上XAD-9大孔樹脂柱,粗提液上柱速度為3BV/h，用pH值為2的酸液洗脫，酸液的洗脫速度為1BV/h，合并流出液和酸洗液。
3. 調節(jié)合并液pH值至中性，過濾，將濾液再次上XAD-3大孔樹脂柱，濾液的上柱速度為為0.5BV/h，用體積濃度為30%的乙醇洗脫，乙醇洗脫述度為2BV/h，薄層層析跟蹤檢測，收集含有積雪草酸成分的乙醇洗脫液。再用體積濃度為55%的乙醇洗脫，乙醇洗脫速度為2BV/h薄層層析跟蹤檢測，收集含羥基積雪草酸的乙醇洗脫液，將羥基積雪草酸洗脫液回收乙醇，干燥，得到羥基積雪草酸。
經HLPC分析,羥基積雪草酸的回收率為90.08%以上,純度高達95.27%。
測定積雪草總苷元中的羥基積雪草酸【1】
采用高效液相色譜法(HPLC)對積雪草中的活性物質進行分離檢測研究，但羥基積雪草酸和terminolic acid 在一般的HPLC條件下，無論以恒比例洗脫或梯度洗脫均顯示單一的色譜峰，無法得到理想的分離度。采用β-環(huán)糊精(β-CD)為流動相添加劑對它們進行了分離，并對分離后的物質進行了簡單的確證?？疾炝瞬煌瑵舛鹊?beta;-環(huán)糊精和不同流動相pH對其分離度的影響，建立了積雪草樣品中羥基積雪草酸含最的測定方法。
供試品溶液的制備
精密稱取50%積雪草總苷元適量，置于10 mL容量瓶中，加甲醇溶解并定容至刻度，搖勻，配制成50%積雪草總苷元甲醇溶液5.58 g/L 備用。進樣前用0.45 um微孔濾膜過濾。
羥基積雪草酸和terminolic acid的收集
將50%積雪草總苷元溶液重復進樣，在HPLC檢測器的出口處分段收集羥基積雪草酸和terminolic acid各約40 mL。將收集到的洗脫液蒸干后，利用β-環(huán)糊精在甲醇中溶解度小而羥基積雪草酸和terminolic acid在甲醇中溶解度大的差異，去除β-環(huán)糊精,進樣，進行LC-MSD檢測，對收集的兩種物質進行簡單的確證。
羥基積雪草酸的定量分析
精密稱取羥基積雪草酸對照品10.0 mg，用甲醇配制成10.0g/L的溶液，然后用甲醇進行倍比稀釋，配成質量濃度依次為5.0，2.0，1.0，0.5和0.1g/L的羥基積雪草酸對照品甲醇溶液。以峰面積(y)對質量濃度(x, g/L)進行線性回歸,羥基積雪草酸的回歸方程為y = 116.54x一10. 058，r2=0.9989。結果表明,樣品量在0.1-5.0 g/L范圍內濃度與峰面積呈線性關系。
精密配制羥基積雪草酸對照品0.5,1.0,2.0g/L3種濃度的甲醇溶液，每種濃度重復進樣3次，連續(xù)測定5 d,其峰面積的日間精密度和日內精密度(以相對標準偏差( RSD)值計)均小于2. 0%。
精密量取供試品溶液,按照前面的色譜條件,重復進樣3次,按回歸方程計算供試品的含量,結果表明:50%積雪草總苷元中羥基積雪草酸的平均質量分數(shù)為18. 1%。
參考文獻
[1]潘見，開桂青，袁傳勛，周蓓蓓，金日生，袁 媛，β一環(huán)糊精流動相添加劑法分離測定積雪草 總苷元中的羥基積雪草酸，色 譜 Chinese Journal of Chromatography，2007.05，第317頁