背景^[1-3]

DNA凝膠回收試劑盒采用溫和的溶膠液，可以使瓊脂糖凝膠完全融化，同時(shí)避免在高溫下DNA發(fā)生脫嘌呤和末端水解，保持DNA完整的生物學(xué)活性。采用硅膠膜選擇性吸附DNA的方法回收DNA，適合從TAE或者TBE瓊脂糖凝膠中純化回收多至4μg，長(zhǎng)度介于50bp-10kb的DNA片段，回收率為90%.。純化回收的DNA可直接酶切、連接、轉(zhuǎn)化細(xì)菌、測(cè)序、PCR、雜交等后續(xù)操作。

DNA凝膠回收流程

操作步驟：

1、將切割的凝膠轉(zhuǎn)入預(yù)先稱重的1.5ml離心管中，加入等體積的Buffer GL(100mg的凝膠加入100μl Buffer I)。放入55-60℃水浴中，間斷搖晃混合，直至凝膠完全融化（約5-10min），放置使其冷卻至室溫。

2、將上述混合液加入DNA回收柱內(nèi)，如果溶液體積>700μl，分次轉(zhuǎn)移溶液；室溫放置1-2min或更長(zhǎng)時(shí)間。

3、在13000g離心1分鐘，棄廢液。目的DNA長(zhǎng)度≤500bp時(shí)，離心結(jié)束后將收集管中的溶液再次轉(zhuǎn)入DNA純化柱中，離心。

4、在DNA純化柱中加入650μl Wash Buffer，13,000g離心30秒，棄廢液，將DNA純化柱放回收集管。

5、重復(fù)步驟4。

6、13000g離心3 min，以去除柱中殘余乙醇。

7、將純化柱放入新的離心管中，向柱中加入在60℃下預(yù)熱的30-50μl Elution Buffer或ddH2O，室溫放置1-2min或更長(zhǎng)時(shí)間。

注意：

a.加入Elution Buffer后將柱子整個(gè)溫育5min后再離心洗脫可以增加DNA回收效率。

b.對(duì)大于8Kb的片段，加溶液Elution Buffer后將柱子整個(gè)溫育15-30min可以提高回收效率。

8、13,000g離心1 min，所得液體即為高純度DNA。

應(yīng)用^[4][5]

用于類病毒cDNA體外連接產(chǎn)物回收中出現(xiàn)的非特異條帶原因探究

瓊脂糖凝膠電泳是分子生物學(xué)試驗(yàn)中常用的DNA分析方法。本文通過(guò)瓊脂糖凝膠電泳分析和回收啤酒花矮化類病毒（Hop Stunt viroid,HSVd）cDNA體外連接產(chǎn)物中二聚體時(shí),常發(fā)現(xiàn)回收的二聚體產(chǎn)物中有單倍體和其他非目標(biāo)條帶存在,為了明確該現(xiàn)象發(fā)生的原因,開(kāi)展了相關(guān)實(shí)驗(yàn)。

結(jié)果如下:1.分別通過(guò)PCR擴(kuò)增和體外連接獲得HSVd cDNA單倍體、二倍體及二倍體以上的多聚體片段混合產(chǎn)物樣品,通過(guò)瓊脂糖凝膠電泳回收其中的二聚體,回收產(chǎn)物再經(jīng)過(guò)聚丙烯酰銨凝膠（Polyacrylamide acrylamide gel,PAGE）電泳,結(jié)果顯示,除了二聚體外,從兩種產(chǎn)物中還回收到了單倍體和其他非目標(biāo)條帶。

2. 通過(guò)體外連接,獲得桃潛隱花葉類病毒（Peach latent mosaic viroid,PLMVd）三個(gè)分離物和真菌TP-3-1延伸因子的單倍體、二倍體及二倍體以上的多聚體片段混合產(chǎn)物樣品,然后通過(guò)瓊脂糖凝膠電泳回收其二聚體,結(jié)果顯示,對(duì)4個(gè)樣品回收的二聚體產(chǎn)物中均存在單倍體和其他非目標(biāo)條帶。結(jié)果表明這種現(xiàn)象不僅存在HSVd的cDNA中,而且也存在于其他類型的DNA中,是一種普遍現(xiàn)象。

3.選取通過(guò)PCR獲得的HSVd cDNA單倍體、二倍體及二倍體以上的多聚體片段混合產(chǎn)物,使用4種不同品牌的瓊脂糖凝膠回收試劑盒回收其二聚體,回收產(chǎn)物經(jīng)PAGE電泳,結(jié)果顯示回收產(chǎn)物中除二聚體外均有單倍體和非目標(biāo)條帶,表明這種非特異反應(yīng)與選用的膠回收試劑盒品牌無(wú)關(guān)。

參考文獻(xiàn)

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[3]Fangman W L.Nucleic Acids Research.1978

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[5]劉森.類病毒cDNA體外連接產(chǎn)物回收中出現(xiàn)的非特異條帶原因探究[D].華中農(nóng)業(yè)大學(xué),2016.