背景^[1-3]

PCR優(yōu)化試劑盒提供8種耐熱聚合酶和相應(yīng)的精心配制的緩沖液，其中緩沖液的pH值，鹽離子濃度和助溶劑成分等各不相同，當擴增某些復(fù)雜的基因模板等出現(xiàn)問題時，應(yīng)測試不同的聚合酶及反應(yīng)緩沖體系。

另外，PCR優(yōu)化試劑盒還提供了PCR增強劑，能增加引物的特異性，提高DNA聚合酶的熱穩(wěn)定性，適應(yīng)較寬范圍的退火溫度和Mg2+濃度?？梢栽谠噭┖刑峁┑?種聚合酶及相應(yīng)反應(yīng)體系的基礎(chǔ)上再添加PCR增強劑，以找到PCR最適反應(yīng)體系從而達到的PCR反應(yīng)效果。

PCR優(yōu)化膠圖

聚合酶鏈式反應(yīng)（PCR）是一種用于放大擴增特定的DNA片段的分子生物學(xué)技術(shù)，它可看作是生物體外的特殊DNA復(fù)制，PCR的特點是能將微量的DNA大幅增加。

PCR是利用DNA在體外攝氏95°高溫時變性會變成單鏈，低溫（經(jīng)常是60°C左右）時引物與單鏈按堿基互補配對的原則結(jié)合，再調(diào)溫度至DNA聚合酶最適反應(yīng)溫度（72°C左右），DNA聚合酶沿著磷酸到五碳糖(5'-3')的方向合成互補鏈?；诰酆厦钢圃斓腜CR儀實際就是一個溫控設(shè)備，能在變性溫度，復(fù)性溫度，延伸溫度之間很好地進行控制。

標準的PCR過程分為三步：

DNA變性：（90℃-96℃）：雙鏈DNA模板在熱作用下，氫鍵斷裂，形成單鏈DNA

退火：（60℃-65℃）：系統(tǒng)溫度降低，引物與DNA模板結(jié)合，形成局部雙鏈。

延伸：（70℃-75℃）：在Taq酶（在72℃左右，活性）的作用下，以dNTP為原料，從引物的3′端開始以從5′→3′端的方向延伸，合成與模板互補的DNA鏈。

每一循環(huán)經(jīng)過變性、退火和延伸，DNA含量即增加一倍。如圖所示：現(xiàn)在有些PCR因為擴增區(qū)很短，即使Taq酶活性不是也能在很短的時間內(nèi)復(fù)制完成，因此可以改為兩步法，即退火和延伸同時在60℃-65℃間進行，以減少一次升降溫過程，提高了反應(yīng)速度。

應(yīng)用^[4][5]

用于食品中單增李斯特菌的分離鑒定及PCR快速檢測方法的研究

基于單增李斯特菌MyA基因和李斯特菌屬的16sRNA基因分別合成兩對引物,對影響PCR的主要因素進行優(yōu)化,建立可同時檢測兩個特異基因的PCR方法,即雙重PCR方法及熒光PCR方法。

將兩種PCR檢測方法分別與選擇增菌法結(jié)合,應(yīng)用在食品樣品的檢測中。此雙重PCR方法特異性良好,對純菌液的檢測靈敏度為3.2×102CFU/mL,模擬污染的海螺檢測限為4CFU/g。應(yīng)用該雙重PCR方法對市場隨機抽取的126份新鮮海螺樣品進行檢測,檢測結(jié)果經(jīng)GB 4789.30-2010驗證。

驗證結(jié)果表明,出現(xiàn)雙條帶的海螺樣品為陽性樣品,無條帶出現(xiàn)或僅出現(xiàn)單一條帶的海螺樣品為陰性樣品。126份海螺樣品中共檢出陽性樣品16份,檢出率為12.7%。

此熒光PCR方法的反應(yīng)液經(jīng)凝膠電泳驗證,結(jié)果顯示,擴增出的兩條不同大小、不同Tm值的目的核酸片段,分別對應(yīng)兩條熒光PCR溶解曲線上的兩個獨立波峰?；趩卧隼钏固鼐鷋lyA基因建立標準曲線,相關(guān)系數(shù)為0.996,最低檢出限約為89CFU/mL。

參考文獻

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[2]Simultaneous detection of pathogenic B.cereus,S.aureus and L.monocytogenes by multiplex PCR[J].T.D.Kalyan Kumar,H.S.Murali,H.V.Batra.Indian Journal of Microbiology.2009(3)

[3]Evaluation of a multiplex PCR assay as an alternative method for Listeria monocytogenes serotyping[J].Journal of Microbiological Methods.2009(2)

[4]Subversion of cellular functions by Listeria monocytogenes[J].JavierPizarro‐Cerdá,PascaleCossart.J.Pathol..2005(2)

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