【背景及概述】[1] [2][3]
對(duì)微生物產(chǎn)生溶菌酶的研究，最早可追溯于Nicoile 1907 年發(fā)表枯草芽孢桿菌溶解因子的報(bào)告開(kāi)始。從20 世紀(jì)中期以來(lái)，研究較多的有擬內(nèi)串生孢霉(Chalarosis)、球孢鏈霉菌(S trep tomy ces globisporus)、灰色鏈霉菌(S trep tomy ces griseus)、蠟狀芽孢桿菌(Baci lus cereus)、丙酮丁酸梭菌(Clostrid iumacetobuty l icum)、乳酸乳球菌(Lactococcus lacti s)、肺炎鏈球菌(S .pneumoniae)以及幾種細(xì)菌噬菌體等產(chǎn)生的溶菌酶，日本和德國(guó)在微生物溶菌酶的研究較多，國(guó)內(nèi)山東大學(xué)微生物國(guó)家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室在這方面做了較多工作。對(duì)溶菌酶的研究始于20世紀(jì)初，人們發(fā)現(xiàn)人的唾液、眼淚中存在有溶解細(xì)菌細(xì)胞壁的酶，因其具有溶菌作用，故命名為溶菌酶。1937年Abraham和Robinson從卵蛋白中分離出溶菌酶晶體，揭開(kāi)了研究溶菌酶的歷史篇章。它廣泛存在于鳥(niǎo)類、家禽的蛋清中和哺乳動(dòng)物的淚液、唾液、血漿、乳汁、胎盤(pán)以及體液、組織細(xì)胞內(nèi)，其中在蛋清中含量最豐富。在一些植物體如卷心菜、蘿卜、無(wú)花果和微生物體內(nèi)也存在溶菌酶，只是含量差異較大。
最新研究表明將溶菌酶固定化在食品包裝材料上，生產(chǎn)出有抗菌功效的食品包裝材料，以達(dá)到抗菌保鮮功能；將溶菌酶固定化在HEPA上，作為空調(diào)的空氣凈化系統(tǒng)，使其具有高效除塵和殺菌兩大功能。當(dāng)空氣通過(guò)濾網(wǎng)時(shí)，先濾集捕捉塵粒和細(xì)菌，然后將捕捉到的細(xì)菌殺滅；用溶菌酶非專一性地降解海洋生物高分子殼聚糖，使其成為能被人體吸收的低分子量具有獨(dú)特生理活性和功能性質(zhì)的低聚殼聚糖。
【理化性質(zhì)與結(jié)構(gòu)】[2][3]
溶菌酶(Lysozyme)是水解酶的一種，又稱為胞壁質(zhì)酶(muramidase)或N-乙酰胞壁質(zhì)肽聚糖水解酶(Nacetylmuramideglycanohydrlase)。溶菌酶是一種堿性蛋白質(zhì)，在酸性環(huán)境下，溶菌酶對(duì)熱的穩(wěn)定性很強(qiáng)，pH值3.0時(shí)96℃加熱處理15min仍能保持87%的酶活性。在自然條件下，大多數(shù)溶菌酶化學(xué)性質(zhì)穩(wěn)定，即使當(dāng)pH值在1.2～11.3范圍內(nèi)劇烈變化，其酶結(jié)構(gòu)仍維持不變，活性也不受影響。但堿很容易使酶活性遭到破壞，當(dāng)處于堿性pH值范圍時(shí)，溶菌酶的熱穩(wěn)定性就很差。溶菌酶在干燥條件下，室溫可長(zhǎng)期保存，其純品為白色或微黃色結(jié)晶體或無(wú)定型粉末，無(wú)嗅，味甜，易溶于水，不溶于丙酮、乙醚。其分子結(jié)構(gòu)如下：
【分類】[2]
溶菌酶的底物特異性很強(qiáng)，不同來(lái)源溶菌酶作用的底物不同。按溶菌酶的來(lái)源可分為蛋清溶菌酶、動(dòng)物溶菌酶、植物溶菌酶、微生物溶菌酶和細(xì)菌噬菌體溶菌酶按作用細(xì)胞壁不同分為細(xì)菌細(xì)胞壁溶菌酶和真菌細(xì)胞壁溶菌酶。細(xì)菌細(xì)胞壁溶菌酶又細(xì)分為兩種，一種是作用于β -1，4糖苷鍵的細(xì)胞壁溶解酶，另一種是作用于肽鏈尾端和酰胺部分的細(xì)胞壁溶解酶。真菌細(xì)胞壁溶菌酶包括酵母菌細(xì)胞壁溶解酶和霉菌細(xì)胞壁溶解酶。溶菌酶大體分為5種：(1)內(nèi)N-乙酰己糖胺酶，此酶同于雞蛋清溶菌酶，破壞細(xì)菌細(xì)胞壁肽聚糖中的β -1.4 糖苷鍵。(2)酰胺酶，切斷細(xì)菌細(xì)胞壁肽聚糖中N-乙酰氨基葡萄糖胺與肽尾之間的N-乙酰胞壁酸-L-丙氨酸鍵。(3)內(nèi)肽酶，使肽尾及肽橋內(nèi)的肽鍵斷裂。(4)β -1.3、β -1.6葡聚糖酶和甘露聚糖酶，此酶分解酵母細(xì)胞的細(xì)胞壁。(5)殼多糖酶，這是分解霉菌細(xì)胞壁的一種溶菌
【適應(yīng)癥】[4]
溶菌酶臨床用于慢性鼻炎、急慢性咽喉炎、口腔潰瘍、水痘、帶狀皰疹、扁平疣、哮喘性氣管炎、支氣管哮喘、潰瘍性結(jié)腸炎、腮腺炎等。
【規(guī)格及用量】 [4]
1. 腸溶片：10mg?？诜?，每日3次，每次3～5片。治療水痘，10mg/(kg·d)，分3～4次服。
2. 口含片：每片20mg，每日4～6次，每次 1片。
3. 外用，用生理鹽水或注射用水或甘油配成1%～2%溶液外擦，或直接噴撒藥粉。
【藥理作用】
溶菌酶系從鮮雞蛋清中提取的一種能分解粘多糖的多肽酶。能使各種微生物細(xì)胞壁中的不溶性粘多糖類轉(zhuǎn)變?yōu)榭扇苄哉畴念惗l(fā)揮抗菌作用，在細(xì)胞內(nèi)對(duì)被吞噬的病原菌起破壞作用。具有抗菌、抗病毒、止血消腫、清除局部壞死組織、痰液變稀、加強(qiáng)組織功能恢復(fù)等作用。
【注意事項(xiàng)】[4]
肌注可發(fā)生過(guò)敏反應(yīng)而致死，3歲以下小兒較易出現(xiàn)，故一般不采用注射給藥。溶液宜新鮮配制。口服偶有過(guò)敏。
【其他應(yīng)用】[2]
1. 在食品工業(yè)中的應(yīng)用
溶菌酶是一種無(wú)毒、無(wú)副作用的蛋白質(zhì)，又具有溶菌作用，因此可用作食品防腐劑。目前已廣泛應(yīng)用于水產(chǎn)品、肉食品、蛋糕、清酒、料酒及飲料中的防腐，溶菌酶屬于冷殺菌，在殺菌防腐過(guò)程中不需加熱，因而避免了高溫殺菌對(duì)食品風(fēng)味的破壞作用，尤其對(duì)熱敏感的物質(zhì)更具有重要意義。還可以添加到乳粉中，使牛乳人乳化，以抑制腸道中腐敗微生物的生存，同時(shí)直接或間接促進(jìn)腸道中雙歧桿菌的增殖。此外，還能利用溶菌酶生產(chǎn)酵母浸膏和核酸類調(diào)味品。
2. 在生物工程研究中的應(yīng)用
隨著生物科學(xué)的發(fā)展，溶菌酶已成為基因工程及酶工程中必不可少的工具酶，用以制造和提取菌體內(nèi)的活性物質(zhì)如核酸、酶及活性多肽等，利用其專一性水解細(xì)胞壁的特點(diǎn)，有助于人們對(duì)細(xì)胞壁細(xì)微結(jié)構(gòu)的認(rèn)識(shí)，為我們深入研究細(xì)胞壁的構(gòu)造打下了堅(jiān)實(shí)的基礎(chǔ)，同時(shí)作為是一種重要的破壁酶，在原生質(zhì)體的制備方面提供了新的方法，因此溶菌酶被廣泛應(yīng)用于生物技術(shù)、生物工程中。
3. 溶菌酶在畜禽飼料中的應(yīng)用
1）用作飼料防腐劑和殺菌劑：由于溶菌酶本身是一種天然蛋白質(zhì)，無(wú)毒性，是一種安全性高的飼料酶，它能專一性的作用于目的微生物的細(xì)胞壁，而不能作用于其它物質(zhì)。該酶對(duì)革蘭氏陽(yáng)性菌、枯草桿菌、耐輻射微球菌有很強(qiáng)分解作用；對(duì)大腸桿菌、普通變形菌和副溶血弧菌等革蘭氏陰性菌等也有一定的殺滅作用；與聚合磷酸鹽和甘氨酸等配合使用，具有良好的防腐作用。在飼料中添加溶菌酶可防止霉變，延長(zhǎng)飼料的貯存期，減少不必要損耗。
2）具有防治仔豬腹瀉的作用：溶菌酶對(duì)防治仔豬腹瀉有顯著作用，可達(dá)到抗生素的使用效果，治愈率達(dá)80%以上。溶菌酶與免疫球蛋白的功能緊密聯(lián)系體內(nèi)溶菌酶主要來(lái)自嗜中性白細(xì)胞、單核細(xì)胞及吞噬細(xì)胞溶酶體，可進(jìn)入機(jī)體補(bǔ)體系統(tǒng)并增強(qiáng)抗體活性，從而殺滅有害微生物，因此溶菌酶對(duì)引起仔豬腹瀉的埃希氏大腸桿菌和輪狀病毒都具有較強(qiáng)的抑制作用。
【提取】
1. 直接結(jié)晶法
此法操作簡(jiǎn)單，成本低，但不能用以分離微量的溶菌酶。
2. 親和色譜法
此法分離提純的倍數(shù)較高，質(zhì)量較好，且可廣泛應(yīng)用于各種來(lái)源的溶解酶，用于濃縮和精制微量的溶解酶。但由于親和吸附劑的制作復(fù)雜，限制了它在工業(yè)上的大規(guī)模利用。
3. 離子交換法( Ion- exchange chromatography)
利用溶液中各種帶電粒子與離子交換劑之間結(jié)合力的差異進(jìn)行物質(zhì)分離的操作技術(shù)，由于具有簡(jiǎn)便、高效、成本低，且可自動(dòng)化連續(xù)操作的優(yōu)點(diǎn)，因此一直以來(lái)都是溶菌酶生產(chǎn)所常用的方法。常用的離子交換劑有Duolite- 464、羧酸纖維素( PC) 、羧甲基纖維素( CMC) 和羧甲基瓊脂糖等。此法具有簡(jiǎn)便、高效、成本低、且可自動(dòng)化連續(xù)操作的優(yōu)點(diǎn)。
4. 超濾與親和色譜法結(jié)合
這是近年來(lái)開(kāi)發(fā)的新方法。首先用超濾除去大部分雜蛋白，保留溶解酶，但此時(shí)它還是粗酶，再用親和色譜法得到精制產(chǎn)品。
【制備】
1. 天然資源的溶菌酶的制備
1）雞蛋清溶菌酶的制備
雞蛋清中溶菌酶的含量約為3.5 %，是提取溶菌酶的方便來(lái)源。但不同產(chǎn)地的雞蛋，其蛋清中溶菌酶的含量也有所不同。工業(yè)上多采用直接結(jié)晶法、親和色譜法、離子交換法、超濾與親和色譜聯(lián)合使用等方法生產(chǎn)溶菌酶。采用控制溫度、調(diào)酸和加鹽的分離純化工藝將溶菌酶分離，之后利用超濾和噴霧干燥方法制成產(chǎn)品，產(chǎn)品活力達(dá)11 000 U/mg。利用親和沉淀從蛋清中分離溶菌酶也是溶菌酶制備研究的一個(gè)熱點(diǎn)。
2）蘿卜溶菌酶的制備
國(guó)內(nèi)有人在對(duì)華南地區(qū)50 多科120 多種植物進(jìn)行普查中，發(fā)現(xiàn)十字花科蘿卜葉中溶菌酶含量最高，且發(fā)現(xiàn)蘿卜溶菌酶的耐熱性、耐酸性均優(yōu)于雞蛋清溶菌酶。進(jìn)一步研究發(fā)現(xiàn)，該酶的抑菌效果與現(xiàn)在普遍生產(chǎn)和應(yīng)用的雞蛋清溶菌酶有所不同。該酶不但對(duì)白色葡萄球菌等3 種革蘭氏陽(yáng)性菌，而且對(duì)大腸桿菌等6種格蘭氏陰性菌及酵母、毛霉等5 種真菌具有不同程度的抑制作用，對(duì)另外參試的白菜軟腐病等7 種植物病原細(xì)菌、真菌及煙蟲(chóng)和小菜蛾兩種昆蟲(chóng)都有抑殺作用。
蘿卜溶菌酶抑菌的廣譜性和較強(qiáng)的抑菌能力，以及原料成本低廉等特點(diǎn)，都為蘿卜溶菌酶提供了良好的應(yīng)用前景。
3）馬奶溶菌酶的制備
將蒙古馬奶經(jīng)過(guò)硫酸銨沉淀，乳清蛋白脫鹽，DEAE - Sephadex A- 25，Sephadex G- 100，CMSephadexC- 25 柱層析分離得到馬奶溶菌酶，產(chǎn)率為38 mg/L馬奶。
3. 利用基因工程技術(shù)制備溶菌酶
以噬菌體T7DNA 為模板，PCR 擴(kuò)增T7 溶菌酶基因，插入pBluescript SK 載體。DNA 序列分析表明，克隆的T7 溶菌酶基因和已報(bào)道的序列無(wú)水平上的差異。將T7 溶菌酶基因分別拼接在煙草病原相關(guān)蛋白( PRlb) 信號(hào)肽碼序列的3’末端和馬鈴薯卷葉病毒外殼蛋白( PLRV CP) 基因靠近3’末端處，構(gòu)建成兩個(gè)融合蛋白基因。將T7 溶菌酶及其融合蛋白基因插入大腸桿菌表達(dá)載體pBV221，實(shí)現(xiàn)T7 溶菌酶基因在大腸桿菌中的高效表達(dá)，其產(chǎn)物的表達(dá)量占菌體可溶性蛋白的20 % 以上。
【主要參考資料】
[1] 曹濤, 劉同軍, 王艷君. 微生物溶菌酶的研究及應(yīng)用[J]. 中國(guó)調(diào)味品, 2011, 36(3): 23-26.
[2] 陳艷, 江明鋒, 葉煜輝, 等. 溶菌酶的研究進(jìn)展[J]. 生物學(xué)雜誌, 2009, 26(2): 64-66.
[3] 李鶴, 馬力, 王維香. 溶菌酶的研究現(xiàn)狀[J]. 食品研究與開(kāi)發(fā), 2008 (1): 182-185.
[4] 臨床常用藥物