背景[1-3]
恒河猴骨髓間充質(zhì)干細胞完全培養(yǎng)基是恒河猴骨髓間充質(zhì)干細胞體外培養(yǎng)的含血清培養(yǎng)基，可以在恒河猴骨髓間充質(zhì)干細胞體外傳代和分化培養(yǎng)。
恒河猴（Macaca mulatta）被廣泛應(yīng)用于生命科學研究領(lǐng)域,是被研究得最清楚的舊世界猴（舊世界猴與新世界猴的主要差別在于鼻部，新世界猴的鼻部軟骨間隔很寬，鼻孔開向側(cè)方，鼻孔間距較寬，舊世界猴的鼻間距則很窄，恒河猴組織結(jié)構(gòu)、生理功能與人相似，被廣泛應(yīng)用于生命科學研究領(lǐng)域。
骨髓原始間充質(zhì)干細胞是骨髓基質(zhì)干細胞，是人們在哺乳動物的骨髓基質(zhì)中發(fā)現(xiàn)的一種具有分化形成骨、軟骨、脂肪、神經(jīng)及成肌細胞的多種分化潛能的細胞亞群。它們對骨髓中的造血干細胞（HSC）不僅有機械支持作用，還能分泌多種生長因子（如IL-6，IL-11，LIF，M-CSF及SCF等）來支持造血。
基礎(chǔ)培養(yǎng)基添加血清、抗生素等物質(zhì)后，叫完全培養(yǎng)基，也叫（血清）細胞培養(yǎng)基?；A(chǔ)培養(yǎng)基只能維持細胞生存，要想使細胞生長和繁殖，還需添加天然培養(yǎng)基，常用的是牛血清，因為牛血清中含有促細胞增殖的各種生長因子和其他多種有利于細胞生存的物質(zhì)。此外為防止污染，培養(yǎng)液中尚需加一定量的抗生素。完全培養(yǎng)基根據(jù)添加血清量的多少，可分為細胞生長培養(yǎng)基和細胞維持培養(yǎng)基，用于不同細胞和不同研究。
應(yīng)用[4][5]
用于骨髓間充質(zhì)干細胞體外誘導為角膜內(nèi)皮樣細胞的實驗研究
利用骨髓間充質(zhì)干細胞多向分化潛能,將骨髓間充質(zhì)干細胞誘導分化為角膜內(nèi)皮樣細胞;探討體外分離提純和培養(yǎng)樹鼩及恒河猴骨髓間充質(zhì)干細胞(BMSCs)的生物學特性:形態(tài)、生長曲線、活性,對其多向分化潛能和表型進行初步鑒定,并將樹鼩及恒河猴各結(jié)果對比。將樹鼩BMSCs與晶體、虹膜、角膜內(nèi)皮細胞非接觸性共培養(yǎng),分析體外誘導成為角膜內(nèi)皮樣細胞的可行性,并進一步探討恒河猴骨髓間充質(zhì)干細胞誘導分化為角膜內(nèi)皮樣細胞的可能性及實驗方案。
方法：取樹鼩及恒河猴脛骨及股骨,去除骨骺端將骨髓沖出收集,采用密度梯度離心法和全骨髓貼壁培養(yǎng)法提取培養(yǎng)BMSCs,利用MTS檢測細胞活性的方法繪制二代及七代細胞生長曲線,使用FITC Annexin V-PI細胞凋亡試劑盒雙染法檢測細胞凋亡情況,利用流式細胞儀分析法檢測細胞表面標志物CD29、CD34、CD45、CD90、CD147的表達。
結(jié)果：樹鼩及恒河猴提取細胞多為長梭形,形態(tài)大小均一,少量細胞有大小數(shù)量不等的觸角,或呈星形;第2代和第7代的細胞生長曲線呈S形,P7代細胞增殖能力弱于P2代;樹鼩細胞凋亡檢測可估算出活細胞的比例為90.120%,死亡細胞為8.77%,凋亡細胞為0.540%;成功培養(yǎng)出樹鼩BMSCs第3代,流式細胞儀檢測CD34、CD45陰性表達分別為0.00%、0.00%,CD90、CD29、CD147陽性表達分別為96.4%,95.8%,91.3%。
角膜內(nèi)皮細胞誘導培養(yǎng)基誘導骨髓間充質(zhì)干細胞兩周后,細胞NSE染色陰性,油紅0染色出現(xiàn)大量紅色脂滴,證實為脂肪細胞。晶體勻漿共培養(yǎng)BMSCsNSE染色陽性,虹膜和角膜內(nèi)皮細胞共培養(yǎng)BMSCs NSE染色陰性。
恒河猴BMSCs細胞凋亡檢測可估算出活細胞的比例為73.83%,死亡細胞為21.76%,凋亡細胞為4.27%;成功培養(yǎng)出恒河猴BMSCs第3代,恒河猴BMSCs流式細胞儀檢測CD34、CD45陰性表達分別為0.00%、0.00%,CD90、CD29、CD147陽性表達分別為98.8%,96.4%,89.7%。
參考文獻
[1]Mesenchymal stem cells from reaming material possess high osteogenic potential and react sensitively to bone morphogenetic protein 7[J].Melanie Hoellig,Fabian Westhauser,Kira Kornienko,Kai Xiao,Gerhard Schmidmaier,Arash Moghaddam.Journal of Applied Biomaterials&Functional Mate.2017(1)
[2]A 3D culture system enhances the ability of human bone marrow stromal cells to support the growth of limbal stem/progenitor cells[J].Sheyla González,Hua Mei,Martin N.Nakatsu,Elfren R.Baclagon,Sophie X.Deng.Stem Cell Research.2016
[3]The Morphofunctional Effect of the Transplantation of Bone Marrow Stromal Cells and Predegenerated Peripheral Nerve in Chronic Paraplegic Rat Model via Spinal Cord Transection[J].Vinnitsa Buzoianu-Anguiano,Sandra Orozco-Suárez,Elisa García-Vences,Sara Caballero-Chacón,Gabriel Guizar-Sahagún,Luis Chavez-Sanchez,Israel Grijalva,John Gensel.Neural Plasticity.2015
[4]Culture medium from TNF-α–stimulated mesenchymal stem cells attenuates allergic conjunctivitis through multiple antiallergic mechanisms[J].Wenru Su,Qian Wan,Jingwen Huang,Longhui Han,Xiaoqing Chen,Guihua Chen,Nancy Olsen,Song Guo Zheng,Dan Liang.The Journal of Allergy and Clinical Immunology.2015(2)
[5]董婧婧.骨髓間充質(zhì)干細胞體外誘導為角膜內(nèi)皮樣細胞的實驗研究[D].昆明醫(yī)科大學,2017.