背景[1-3]
一步法感受態(tài)細(xì)菌制備試劑盒采用經(jīng)濟(jì)快速的方法高效制備大腸桿菌感受態(tài)細(xì)胞，在傳統(tǒng)方法的基礎(chǔ)上簡化了操作步驟，提高了感受態(tài)細(xì)菌的轉(zhuǎn)化效率。該試劑盒已被成功地用于從多種大腸桿菌菌株細(xì)胞制備感受態(tài)細(xì)胞，其中包括常用的克隆株（JM109，DH5α，TOP10等）和表達(dá)菌株（BL21家族）用于基因克隆、質(zhì)粒擴(kuò)增或重組蛋白的表達(dá)。
該試劑盒可采用兩種方法制備感受態(tài)細(xì)胞：標(biāo)準(zhǔn)制備法和快速制備法。這兩種方法制備感受態(tài)細(xì)胞比傳統(tǒng)CaCl2法和Hanahan法更加簡單快捷，不需要0~4°C孵育和傳統(tǒng)的熱擊處理。采用快速方法制備的感受態(tài)細(xì)胞pUC 18質(zhì)粒轉(zhuǎn)化大腸桿菌JM109的轉(zhuǎn)化效率大于1.0×105 cfu/µg；使用標(biāo)準(zhǔn)方法的轉(zhuǎn)化效率大于1.0×106 cfu/µg。
感受態(tài)細(xì)胞制備流程：
1.在平板上挑取單克隆或凍存的甘油菌，接種至2-5 ml合適的培養(yǎng)基中，37°C培養(yǎng)過夜。
2.將過夜培養(yǎng)的菌液按1:100稀釋比例加入到預(yù)熱的新鮮LB培養(yǎng)基中，250 rpm 37°C培養(yǎng)至細(xì)菌生長至早對數(shù)期
（OD600=0.3~0.4）時(shí)，時(shí)間通常為1.5~3 h。
3.將上述培養(yǎng)好的菌液于3,500~5,000 rpm，4°C離心5~10 min，收集細(xì)胞。
4.按照每mL培養(yǎng)菌液加入100µl Buffer的比例加入前邊準(zhǔn)備好的冰上預(yù)冷的1×BT buffer T，用吸頭充分懸浮細(xì)胞，冰上
放置10 min?？芍苯佑糜谵D(zhuǎn)化或分裝后用液氮凍存，-70°C保存?zhèn)溆谩?/p>
應(yīng)用[4][5]
用于銅綠假單胞菌噬菌體PaP3生物學(xué)特性的研究與噬菌體基因組改造的技術(shù)準(zhǔn)備
溶原性噬菌體通過自身攜帶的外源性遺傳物質(zhì)改變著宿主菌及自身的基因組構(gòu)成,進(jìn)而改變了宿主菌的生物學(xué)性狀,對噬菌體展開廣泛深入的研究對于了解噬菌體與宿主的相互作用、揭示生物的多樣性等方面具有重要的意義。因此,噬菌體及其基因組功能的研究成為微生物學(xué)研究的熱點(diǎn)領(lǐng)域之一。
改造后PaP3基因組電轉(zhuǎn)化宿主菌。PaP3基因組電轉(zhuǎn)化宿主菌的條件摸索。純化噬菌體PaP3完整基因組DNA,以銅綠假單胞菌（Pseudomonas aeruginosa）PA3為受體菌,探討電轉(zhuǎn)化基本條件,包括:細(xì)胞生長狀態(tài)、感受態(tài)細(xì)胞的制備方式、電場強(qiáng)度、DNA濃度、細(xì)胞密度等條件對轉(zhuǎn)化效率的影響。
確定了一組適用于電轉(zhuǎn)化噬菌體PaP3基因組DNA的條件:在含50μg/ml紅霉素的LB培養(yǎng)基中培養(yǎng)宿主菌14h—16h,以100mM蔗糖溶液為介質(zhì),在25℃條件下制備感受態(tài)細(xì)胞,適宜的感受態(tài)細(xì)胞濃度為1011/ml,適宜的電轉(zhuǎn)參數(shù)為12kV/cm,300Ω,25μF。在此條件下獲得較高的轉(zhuǎn)化效率,可達(dá)2.1×103pfu/μg DNA。這為改造后噬菌體基因組的電轉(zhuǎn)奠定了基礎(chǔ)。
參考文獻(xiàn)
[1]Whole genome sequencing of a novel temperate bacteriophage of P.?aeruginosa:evidence of tRNA gene mediating integration of the phage genome into the host bacterial chromosome[J].YinlingTan,KebinZhang,XiancaiRao,XiaolinJin,JianjunHuang,JunminZhu,ZhijinChen,XiaomeiHu,XiaodongShen,LinWang,FuquanHu.Cellular Microbiology.2006(2)
[2]Use of Bacteriophages in Combination with Competitive Exclusion to Reduce Salmonella from Infected Chickens[J].H.Toro,S.B.Price,S.McKee,F.J.Hoerr,J.Krehling,M.Perdue,L.Bauermeister.Avian Diseases.2005(1)
[3]Bacterial viruses as human vaccines?[J].Clark,March.Expert Review of Vaccines.2004(4)
[4]Bacteriophage lambda is a highly stable DNA vaccine delivery vehicle[J].Catherine D.Jepson,John B.March.Vaccine.2004(19)
[5]周瑩冰.銅綠假單胞菌噬菌體PaP3生物學(xué)特性的研究與噬菌體基因組改造的技術(shù)準(zhǔn)備[D].第三軍醫(yī)大學(xué),2006.