背景[1-4]
Imprint Ultra Chromatin Immunoprecipitation Kit,Without Controls（染色質(zhì)免疫共沉淀試劑盒）適用于特異性定性免疫沉淀和定量PCR，MS-PCR，DNA測(cè)序和Southern blot DNA微陣列檢測(cè)。
Imprint Ultra Chromatin Immunoprecipitation Kit供了化的緩沖液和試劑配方，利用染色質(zhì)免疫共沉淀的方法來(lái)從染色質(zhì)中選擇性地富集含有特殊DNA序列的染色質(zhì)片段，以此來(lái)研究細(xì)胞中蛋白質(zhì)-DNA的相互作用.Imprint Ultra Chromatin Immunoprecipitation Kit提供了對(duì)細(xì)胞樣品進(jìn)行染色質(zhì)免疫沉淀反應(yīng)所需的所有試劑。并且試劑盒中含有一種陽(yáng)性對(duì)照抗體(RNA聚合酶II抗體)、一種陰性對(duì)照抗體(正常小鼠的IgG)、GAPDH引物(可以作為陽(yáng)性對(duì)照來(lái)保證試劑盒中試劑和操作步驟沒出現(xiàn)問題)。
在大多數(shù)生長(zhǎng)期的哺乳動(dòng)物細(xì)胞中，RNA聚合酶II會(huì)在GAPDH基因啟動(dòng)子上富集，準(zhǔn)備起始轉(zhuǎn)錄，因此該啟動(dòng)子能與RNA聚合酶II發(fā)生免疫沉淀反應(yīng)，而不能與正常小鼠IgG發(fā)生。在本染色質(zhì)免疫沉淀反應(yīng)中，細(xì)胞耦合了甲醛，提取出其中的染色質(zhì)。染色質(zhì)進(jìn)行適當(dāng)?shù)拇驍啵缓蠹尤氲轿⒖字信c其表面上吸附的抗體發(fā)生免疫反應(yīng)。特異性結(jié)合到微孔上的DNA從抗體-捕獲蛋白-DNA復(fù)合物上釋放出來(lái)，翻轉(zhuǎn)后，通過專門設(shè)計(jì)的高速離心柱純化。洗脫下來(lái)的DNA可用于隨后的各種分析。
應(yīng)用[5][6]
用于染色質(zhì)免疫共沉淀技術(shù)解析轉(zhuǎn)錄調(diào)控蛋白Hac1在蛋白分泌調(diào)控中的功能研究
絲狀真菌轉(zhuǎn)錄調(diào)控蛋白Hac1是未折疊蛋白響應(yīng)途徑的重要調(diào)控蛋白,可介導(dǎo)蛋白分泌合成系統(tǒng)中分子伴侶BIP1、二硫鍵異構(gòu)酶PDI1等相關(guān)基因表達(dá)量的上調(diào),從而對(duì)胞外蛋白的分泌產(chǎn)生重要影響。因此深入挖掘蛋白合成分泌系統(tǒng)中受Hac1調(diào)控的基因,解析其功能,有助于闡明絲狀真菌的高效蛋白分泌機(jī)制以及為進(jìn)一步通過遺傳改造提高菌株的蛋白分泌能力提供靶標(biāo)。
以斜臥青霉114-2為材料,對(duì)菌株未折疊蛋白響應(yīng)(UPR)途徑中的轉(zhuǎn)錄調(diào)控蛋白Hac1功能開展研究。通過測(cè)定胞外蛋白濃度并結(jié)合實(shí)時(shí)熒光定量PCR檢測(cè)UPR響應(yīng)代表性基因bipA、pdiA的相對(duì)表達(dá)量,監(jiān)測(cè)UPR的響應(yīng)情況,從而確定染色質(zhì)免疫共沉淀分析的時(shí)間點(diǎn)。通過對(duì)菌絲交聯(lián)時(shí)間及超聲波破碎條件的探索,建立斜臥青霉染色質(zhì)免疫共沉淀關(guān)鍵步驟超聲波破碎方法。利用染色質(zhì)免疫共沉淀及RAPD-測(cè)序技術(shù)篩選出Hac1直接調(diào)控的靶基因,并對(duì)其靶標(biāo)基因3379功能進(jìn)行分析。利用融合PCR和巢式PCR構(gòu)建3379敲除盒,原生質(zhì)體轉(zhuǎn)化菌株敲除3379基因。通過對(duì)敲除菌株的表型觀察及蛋白、酶活測(cè)定,初步鑒定靶基因3379的功能。
參考文獻(xiàn)
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