雙熒光素酶驗(yàn)證MIRNA與靶目標(biāo)基因結(jié)合位點(diǎn)背景^[1]

雙螢光素酶是理想的報告基因，因?yàn)椴溉閯游锛?xì)胞中不含內(nèi)源性螢光素酶，一旦轉(zhuǎn)錄完成立刻就生成功能性的螢光素酶。單報告基因?qū)嶒?yàn)往往會受到各種實(shí)驗(yàn)條件的影響，而雙報告基因則通過共轉(zhuǎn)染的“對照”作為內(nèi)參為試驗(yàn)提供一基準(zhǔn)線，從而可以在程度上減小細(xì)胞活性和轉(zhuǎn)染效率等外在因素對實(shí)驗(yàn)的影響，使得數(shù)據(jù)結(jié)果更為可信。Dual-Luciferase雙螢光素酶報告基因檢測系統(tǒng)在細(xì)胞中同時表達(dá)螢火蟲螢光素酶和海腎螢光素酶，兩者沒有種源同源性并對應(yīng)不同的反應(yīng)底物，故而沒有交叉干擾。利用雙螢光素酶報告基因系統(tǒng)可以對miRNA與靶目標(biāo)基因結(jié)合位點(diǎn)，轉(zhuǎn)錄因子和啟動子結(jié)合位點(diǎn)提供驗(yàn)證服務(wù)。

雙熒光素酶驗(yàn)證MIRNA與靶目標(biāo)基因結(jié)合位點(diǎn)應(yīng)用^[1]

由于miRNA主要通過作用于靶基因的3’UTR起作用，可以將目的基因3’UTR區(qū)域構(gòu)建至載體中報告基因luciferase的后面， 通過比較過表達(dá)或者干擾miRNA后，報告基因表達(dá)的改變（監(jiān)測螢光素酶的活性變化）可以定量反映miRNA對目的基因的抑制作用；結(jié)合定點(diǎn)突變等方法進(jìn)一步確定miRNA與靶基因3’UTR的作用位點(diǎn)。實(shí)驗(yàn)?zāi)康?  驗(yàn)證hsa-mir-21與靶基因Tropomyosin 1 3’UTR是否發(fā)生作用并進(jìn)一步確定hsa-mir-21與靶基因Tropomyosin 1 3’UTR的作用位點(diǎn)。

主要參考文獻(xiàn)

[1] 印翠，張俊玲，施志儀，孫文慧，孫近近。應(yīng)用于miRNA靶標(biāo)檢測的雙熒光素酶報告載體的構(gòu)建及鑒定?！渡锛夹g(shù)通報》2015年 第12期 。