背景^[1-4]

熒光定量PCR引物是指在熒光定量PCR核苷酸聚合作用起始時(shí)，刺激合成的一種具有特定核苷酸序列的大分子，與反應(yīng)物以共價(jià)鍵形式連接，這樣的分子稱為引物。引物通常是人工合成的兩段寡核苷酸序列，一個(gè)引物與靶區(qū)域一端的一條DNA模板鏈互補(bǔ)，另一個(gè)引物與靶區(qū)域另一端的另一條DNA模板鏈互補(bǔ)，其功能是作為核苷酸聚合作用的起始點(diǎn)，核酸聚合酶可由其3端開始合成新的核酸鏈。

體外人工設(shè)計(jì)的引物被廣泛用于聚合酶鏈反應(yīng)、測序和探針合成等。

引物是人工合成的兩段寡核苷酸序列，一個(gè)引物與目的基因一端的一條DNA模板鏈互補(bǔ)，另一個(gè)引物與目的基因另一端的另一條DNA模板鏈互補(bǔ)。在PCR（聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)）技術(shù)中，已知一段目的基因的核苷酸序列，根據(jù)這一序列合成引物，利用PCR擴(kuò)增技術(shù)，目的基因DNA受熱變性后解鏈為單鏈，引物與單鏈相應(yīng)互補(bǔ)序列結(jié)合，然后在DNA聚合酶作用下進(jìn)行延伸，如此重復(fù)循環(huán)，延伸后得到的產(chǎn)物同樣可以和引物結(jié)合。

熒光定量PCR技術(shù)是指在PCR反應(yīng)體系中加入熒光基團(tuán)，通過熒光信號不斷累積而實(shí)現(xiàn)實(shí)時(shí)監(jiān)測PCR全程，然后通過標(biāo)準(zhǔn)曲線對未知模板進(jìn)行定量分析的方法。在實(shí)時(shí)熒光定量PCR中，對全程PCR擴(kuò)增過程進(jìn)行實(shí)時(shí)檢測，根據(jù)反應(yīng)時(shí)間和熒光信號的變化可以繪制成一條曲線。

實(shí)時(shí)熒光定量常用的熒光化學(xué)分類有SYBR Green I法和Tag Man探針法。

①SYBR Green I法：SYBR Green I是一種具有綠色激發(fā)波長的染料，吸收波長約為497 nm，發(fā)射波長約為520 nm，可以和所有的dsDNA雙螺旋小溝區(qū)域結(jié)合。因?yàn)樵谟坞x狀態(tài)下SYBR Green I發(fā)出的熒光較弱，但是當(dāng)它與雙鏈DNA結(jié)合后，熒光就會大大增強(qiáng)，而且熒光信號的增加與PCR產(chǎn)物的增加完全同步。此法的優(yōu)點(diǎn)是它可以監(jiān)測任何dsDNA序列的擴(kuò)增，檢測方法較為簡單，成本較低，但也正是由于熒光染料能和任何dsDNA結(jié)合，如非特異性擴(kuò)增產(chǎn)物和引物二聚體也能與染料結(jié)合而產(chǎn)生熒光信號，使實(shí)驗(yàn)產(chǎn)生假陽性結(jié)果，因此其特異性不如探針法。因?yàn)榉翘禺愋援a(chǎn)物和引物二聚體的變性溫度要比目標(biāo)產(chǎn)物的低，所以可以在熔解曲線反應(yīng)過程中利用軟件分析儀器收集到信號進(jìn)行鑒別。

②TaqMan探針法：TaqMan探針法是具有高度特異性的定量PCR技術(shù)。它的工作原理是在PCR反應(yīng)體系中存在一對PCR引物和一條探針，探針的5′端標(biāo)記有報(bào)告基團(tuán)，3′端標(biāo)記有熒光淬滅基團(tuán)，探針只與模板特異結(jié)合，其結(jié)合位點(diǎn)在兩條引物之間。當(dāng)探針完整的時(shí)候，報(bào)告基團(tuán)的熒光能量被淬滅基團(tuán)吸收，所以儀器搜集不到信號，隨著反應(yīng)的進(jìn)展，Taq酶遇到探針，利用3′→5′外切核酸酶的活性把探針切斷，導(dǎo)致報(bào)告基團(tuán)的熒光能量不能被淬滅基團(tuán)吸收，產(chǎn)生了熒光信號，因此信號的強(qiáng)度就代表了模板DNA的拷貝數(shù)。

應(yīng)用^[5][6]

用于熒光定量PCR快速檢測登革1型病毒

登革病毒主要通過埃及伊蚊和白紋伊蚊等媒介昆蟲傳播,引起登革熱以及發(fā)病率和死亡率很高的登革出血熱和登革休克綜合征。登革病毒病流行于熱帶和亞熱帶地區(qū),每年約有5000萬至1億人感染,是一種分布廣、發(fā)病多、危害較大的人類傳染病,已成為全球公共衛(wèi)生關(guān)注的焦點(diǎn)之一。

隨著分子生物學(xué)技術(shù)的飛速發(fā)展,實(shí)時(shí)熒光定量PCR技術(shù)在生物學(xué)研究中的應(yīng)用越來越廣泛。實(shí)時(shí)熒光定量PCR技術(shù)是指在PCR反應(yīng)體系中加入熒光基團(tuán),利用熒光信號積累實(shí)時(shí)監(jiān)測整個(gè)PCR進(jìn)程,最后通過標(biāo)準(zhǔn)曲線對未知模板進(jìn)行定量分析的方法。它在常規(guī)PCR基礎(chǔ)上添加了熒光染料或熒光探針。熒光染料能特異性摻入DNA雙鏈,發(fā)出熒光信號,而不摻入雙鏈中的染料分子不發(fā)出熒光信號,從而保證熒光信號的增加與PCR產(chǎn)物增加完全同步。熒光探針法是將熒光共振能量傳遞技術(shù)應(yīng)用于常規(guī)PCR中,在探針的5,端標(biāo)記一個(gè)熒光報(bào)告基團(tuán)(R),3,端標(biāo)記一個(gè)淬滅基團(tuán)(Q),兩者可構(gòu)成能量傳遞結(jié)構(gòu),即5,端熒光基團(tuán)所發(fā)出的熒光可被淬滅基團(tuán)吸收或抑制；當(dāng)兩者距離較遠(yuǎn)時(shí),抑制作用消失,報(bào)告基團(tuán)熒光信號增強(qiáng),熒光監(jiān)測系統(tǒng)可接收到熒光信號。

利用以上熒光產(chǎn)生原理,在PCR過程中可以連續(xù)不斷地檢測反應(yīng)體系中熒光信號的變化。當(dāng)信號增強(qiáng)到某一域值(PCR反應(yīng)的前15個(gè)循環(huán)的熒光信號作為熒光本底信號,域值的缺省設(shè)置為3-15個(gè)循環(huán)的熒光信號的標(biāo)準(zhǔn)偏差的10倍)時(shí),Ct值被記錄下來。C代表Cycle,t代表threshold,Ct值的含義是：每個(gè)反應(yīng)管內(nèi)的熒光信號到達(dá)設(shè)定的域值時(shí)所經(jīng)歷的循環(huán)數(shù)。在這一技術(shù)的發(fā)展過程中,兩個(gè)重要的發(fā)現(xiàn)起著關(guān)鍵的作用。

參考文獻(xiàn)

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