一、色譜柱參數(shù)及其意義

選擇色譜柱時應(yīng)考慮不同色譜柱參數(shù)的影響，以下內(nèi)容對色譜柱的參數(shù)進(jìn)行分析。

1、色譜柱尺寸

較長的色譜柱組分保留較強(qiáng)，運行時間較長，柱效更高，分離度效果更好。在實際工作中應(yīng)綜合衡量運行時間和柱效，選擇長度適宜的色譜柱。例如含量測定、溶出檢測對于分離的要求較低，可選用較短的色譜柱，減少運行時間；有關(guān)物質(zhì)一般選擇較長的色譜柱，提高分離效果。

內(nèi)徑小的色譜柱靈敏度較高，峰型更窄，但是載樣量較小。如果載樣量滿足要求，需要更高更尖銳的峰提高靈敏度，可以選擇更小內(nèi)徑。但是如果進(jìn)樣量超過了柱載樣量，色譜峰將極大變寬。所以應(yīng)在靈敏度和載樣量之間綜合衡量。

粒徑小的色譜柱分離度較好，色譜柱壓力更大。如果5μm粒徑的色譜柱分離度稍有不足，則同型號3μm色譜柱的分離度一般會提供令人滿意的選擇性。

如果選擇較小尺寸的色譜柱，應(yīng)衡量柱外死體積對柱效的影響，柱外死體積包括連接管線、進(jìn)樣體積、色譜柱接頭與色譜柱連接處的空隙等。所以一般超高效液相使用的色譜柱不適用于常規(guī)液相儀。小規(guī)格色譜柱使用同一品牌的儀器，減少連接處空隙引入的死體積。題外話：島津、安捷倫、waters之間儀器管線接頭和色譜柱不匹配，儀器和色譜柱品牌不一致必然引入較大連接空隙，應(yīng)注意這方面的影響。

2、其他參數(shù)

高比表面積具有較強(qiáng)的保留能力、柱容量和分離度，低比表面積能更快達(dá)到平衡狀態(tài)，這點在梯度淋洗中很有意義。

大孔徑的填料可以延長大分子在填料中的滯留時間，達(dá)到充分分離，改善峰型。大分子樣品一般應(yīng)選擇較大孔徑色譜柱，如蛋白質(zhì)、多肽類。

單齒鍵合色譜柱平衡更快；雙齒鍵合穩(wěn)定性較好，柱容量較大。

碳栽量大保留較強(qiáng)，分離效果較好。反之保留較弱，分離效果較差。

封尾（也稱封端）柱能減輕堿性組分（陽離子）與硅膠表面殘留硅氧負(fù)離子作用而引起的色譜峰拖尾現(xiàn)象；對于極性樣品經(jīng)封尾處理與未經(jīng)封尾處理的色譜柱選擇性也不同。一般堿性化合物應(yīng)選擇封尾處理的色譜柱。

二、常見固定相解析

1、直鏈烷烴（C18、C8、C6、C4、C3……）

非極性和極性較弱的化合物常選擇該類固定相色譜柱。一般來說，鏈長越長，柱容量更大，保留時間更長，分離效果更好，柱穩(wěn)定性更好。因此C18是最常用的一種反相色譜柱，但是某些組分如大分子樣品因其保留太強(qiáng)，使用C18難以洗脫，會用到更短鏈固定相色譜柱（如C4等）。在開發(fā)方法的時候如果使用C18柱，最難洗脫的組分在流動性允許的有機(jī)相最高比例下保留仍然太強(qiáng)導(dǎo)致運行時間際過長，就可以考慮使用C8柱。

該類固定相的保留機(jī)制是“相似相溶”的液液分配色譜，固定相為小極性碳鏈，組分中依極性大小的不同而保留不同，極性越小保留越強(qiáng)。組分在該類色譜柱中的保留可根據(jù)極性的相對大小判斷不同組分的洗脫順序。例如苯與苯酚，苯酚因為多了一個羥基，極性變大，在C18柱中更快洗脫下來。

該類柱在方法開發(fā)上有一個的優(yōu)點是保留情況可以預(yù)測，比如一般減少有機(jī)相比例會增加保留，分離度增加等等。

2、苯基 

保留機(jī)制同直鏈烷烴，它對于含苯環(huán)結(jié)構(gòu)的化合物有良好的分辨能力，尤其是苯環(huán)上的細(xì)微差別，如結(jié)構(gòu)式中有無鹵素、官能團(tuán)在苯環(huán)所處位置不同等。

3、氰基

CN(氰基)填料由于其具有中等極性的氰基鍵合固定相，其既可用于正相色譜，又可用于反相色譜。其在用于正相色譜時，可使用如正己烷的低極性流動相，在用于反相色譜時，可使用甲醇或水的強(qiáng)極性流動相。

CN柱的疏水性在反相色譜固定相中相對較低，并且由于具有π-電子作用腈基，其與ODS相比顯示出不同的選擇性。CN柱適用于在ODS上保留時間太長的組分的分離，以及在ODS上優(yōu)化色譜非常困難的場合。CN柱也可用于在ODS上保留太小的強(qiáng)極性化合物的檢測。如果組分間極性相差太大，CN柱或許可以提供一個令人滿意的結(jié)果。如本人曾經(jīng)在一個項目的溶出方法學(xué)研究中發(fā)現(xiàn)，藥典方法規(guī)定的C18柱在多次分析溶出樣品后主峰變形，經(jīng)過調(diào)查確認(rèn)是膠囊殼中強(qiáng)保留組分無法洗脫引起，于是選擇CN柱，連續(xù)分析數(shù)千樣品，柱效依然良好。

CN柱的保留隨著有機(jī)相比例變化的趨勢不像直鏈烷烴柱那么明顯，有些情況下有機(jī)相變化百分之幾十，保留時間也未發(fā)生明顯變化，這點需要注意。

4、氨基

氨基柱是由極性基團(tuán)氨丙硅烷基鍵合在硅膠上形成的極性鍵合相色譜柱。一般可正相使用，也可反相使用。一般用于糖類、碳水化合物的分析。

目前氨基柱的分離原理主流說法是氫鍵作用力及范德華力，由此可以看出氨基柱一般不用于易解離化合物的分析。原因有二：一是氨基柱非常不穩(wěn)定，易解離化合物一般都需要使用緩沖鹽，加速了氨基柱固定相的破壞；二是氨基柱對于易解離化合物的保留機(jī)制非常復(fù)雜，除了上述的氫鍵和范德華力外，還有離子交換色譜的機(jī)制，如堿性化合物與氨基固定相相互離子間排斥、酸性化合物與氨基相互吸引等，使得色譜行為更加難以預(yù)測。目前氨基柱最常用于糖類的分析，流動性使用水-有機(jī)相系統(tǒng)。

該類色譜柱的缺點就是穩(wěn)定性差，柱的使用壽命非常短。

5、HILIC（親水作用色譜）

本柱為兩性離子的固定相共價結(jié)合于多孔硅膠上，適用于反相色譜中保留較弱或者根本不保留的強(qiáng)離子化樣品檢測，解決了正相色譜用于該領(lǐng)域樣品難以溶解性的問題。這是比較新的一類色譜柱，目前相應(yīng)的研究內(nèi)容較少。

HILIC柱的分離機(jī)制非常復(fù)雜，主要包括以下幾個方面：液液分配、離子交換、偶極-偶極間作用、氫鍵等，很多實驗表明HILIC的保留機(jī)制是上述多種機(jī)制的共同作用。

典型的HILIC流動相一般為水或緩沖液中含40%-97%乙腈，一般不應(yīng)使用純乙腈。組分的保留時間一般隨著有機(jī)相比例的增加而增加，隨著水的比例增加而減少。所以梯度設(shè)置和反相色譜正好相反，是一個有機(jī)相比例逐漸減少的過程。

樣品不得使用純水溶解，水的比例與流動相初始比例一致，原理與反相色譜常見的“溶劑效應(yīng)”一樣。

6、離子交換柱

分為陰離子交換柱和陽離子交換柱，主要用于強(qiáng)離子組分的檢測，如金屬離子、酸根等的檢測。最常見用于離子色譜儀，如組分有紫外響應(yīng)，也可以用于一般液相儀中。其原理及應(yīng)用已有較多的研究內(nèi)容，本文就不做詳細(xì)介紹。

7、其他

上述6類色譜柱已經(jīng)包含了絕大部分的實驗室常見色譜柱，其他如手性柱或特殊填料色譜柱由于性質(zhì)差異較大或應(yīng)用較少，篇幅有限本文就不做詳細(xì)介紹了。

三、色譜柱相關(guān)的一些其他內(nèi)容

1、色譜柱流向

一般來說，應(yīng)安裝色譜柱上規(guī)定的箭頭方向設(shè)置流動相的方向。如色譜柱壓力明顯增高，可將色譜柱斷開檢測器調(diào)頭反沖，如此操作之后色譜柱反向使用。避免頻繁更換色譜柱中流動相的流向，因為色譜柱的鍵合相是有排列方向的，頻繁更換色譜柱中流動相的流向會破壞這種排列，降低色譜柱性能。

2、pH值穩(wěn)定性

上文中提過鍵合相碳鏈越長越穩(wěn)定，其意義是越長的碳鏈在低pH值下不易水解，由此可以得出結(jié)論是經(jīng)過短鏈封尾處理的色譜柱應(yīng)避免在低pH值（＜2)條件下使用。在高pH值下，由于硅膠上帶有硅氧負(fù)離子，硅膠將會溶解，由此可以得出封尾處理后的色譜柱在高pH值下穩(wěn)定性較好的結(jié)論。在方法開發(fā)及樣品檢測中可以根據(jù)上述結(jié)論選擇色譜柱，提高色譜柱壽命。

四、后述

之前在拙著《液相方法開發(fā)指南-反相色譜》一文中挖了一個關(guān)于色譜柱的坑，估計會有讀者心中不滿，看完本文親應(yīng)該能發(fā)現(xiàn)并非有意這么做，實在是內(nèi)容太多，一篇文章包含不了那么多的內(nèi)容。當(dāng)然還是要向各位致歉。