活性氧檢測試劑盒(DHE熒光探針法)

中文名稱：活性氧檢測試劑盒(DHE熒光探針法)

英文名稱：ROS detection kit(DHE probe)

產(chǎn)品規(guī)格：200T

本試劑盒是一種利用熒光探針DHE(Dihydroethidium)進(jìn)行活性氧檢測的試劑盒?？梢杂糜诟鞣N真核培養(yǎng)細(xì)胞、培養(yǎng)或灌流組織及組織冰凍切片的檢測，提供了活性氧陽性對(duì)照試劑，以便于活性氧的檢測。

DHE可自由透過活細(xì)胞膜進(jìn)入細(xì)胞內(nèi)，并被細(xì)胞內(nèi)的ROS氧化，形成氧化乙啶；氧化乙啶可摻入染色體DNA中，產(chǎn)生紅色熒光。根據(jù)活細(xì)胞中紅色熒光的產(chǎn)生，可以判斷細(xì)胞ROS含量的多少和變化。二氫乙啶在細(xì)胞內(nèi)主要被超氧陰離子型ROS氧化，用流式細(xì)胞儀或熒光顯微鏡可直接觀察，是一種快速簡便的組織或培養(yǎng)活細(xì)胞中ROS經(jīng)典檢測方法。在激發(fā)波長535nm，發(fā)射波長610nm附近，使用熒光顯微鏡、激光共聚焦顯微鏡、熒光分光光度計(jì)、熒光酶標(biāo)儀、流式細(xì)胞儀等檢測熒光，從而測定細(xì)胞內(nèi)活性氧水平。

活性氧(Reactive oxygen species, ROS) 包括超氧自由基、過氧化氫、及其下游產(chǎn)物過氧化物和羥化物等，參與細(xì)胞生長增殖、發(fā)育分化、衰老和凋亡以及許多生理和病理過程。

產(chǎn)品特點(diǎn)：
· 使用方便：可用激光共聚焦顯微鏡直接觀察、熒光分光光度計(jì)、熒光酶標(biāo)儀或流式細(xì)胞儀檢測；
· 背景低，靈敏度高；
· 線性范圍寬，使用方便。

試劑盒組成：

保存條件：-20℃避光，有效期6個(gè)月

自備試劑和儀器：
· 培養(yǎng)基
· 移液器及吸頭
· 離心機(jī)
· 激光共聚焦顯微鏡或熒光分光光度計(jì)或酶標(biāo)儀或流式細(xì)胞儀，激發(fā)波長535nm，發(fā)射波長610nm。

使用注意事項(xiàng)：
1．螺旋蓋微量試劑管裝的試劑在開蓋前請(qǐng)短暫離心，將蓋內(nèi)壁上的液體收集至管底，避免開蓋時(shí)液體灑落。
2．熒光探針標(biāo)記后，一定要洗凈殘余的未進(jìn)入細(xì)胞內(nèi)的探針，否則會(huì)導(dǎo)致背景較高。
3．探針標(biāo)記完畢并洗凈殘余探針后，可以進(jìn)行激發(fā)波長的掃描和發(fā)射波長的掃描，以確認(rèn)探針的標(biāo)記情況是否正常。
4．盡量縮短探針標(biāo)記后到測定所用的時(shí)間，以減少各種可能的誤差。
5．對(duì)于藥物作用時(shí)間較短(2小時(shí)以內(nèi))的細(xì)胞，先標(biāo)記探針，后用藥物刺激細(xì)胞。對(duì)于藥物作用時(shí)間較長(6小時(shí)以上)的細(xì)胞，先用活性氧陽性對(duì)照誘導(dǎo)劑或相應(yīng)的藥物刺激細(xì)胞，后標(biāo)記探針。
6．陽性對(duì)照誘導(dǎo)劑可以按照1:1000 的比例使用。例如標(biāo)記好探針的細(xì)胞共1ml，可以加入1μl的陽性對(duì)照誘導(dǎo)劑刺激。通常刺激后20-30 分鐘內(nèi)可以觀察到非常顯著的活性氧水平升高。對(duì)于不同的細(xì)胞，活性氧陽性對(duì)照的效果可能有較大的差別。如果在刺激后30 分鐘內(nèi)觀察不到活性氧的升高，可以適當(dāng)提高活性氧陽性對(duì)照誘導(dǎo)劑的濃度。如果活性氧升高得過快，可以適當(dāng)降低活性氧陽性對(duì)照誘導(dǎo)劑的濃度。
7．DHE在光照和空氣中易被氧化，注意避光密封保存。
8．對(duì)不同的細(xì)胞和組織，應(yīng)選擇合適的孵育時(shí)間和濃度，以觀察ROS的變化。

使用方法：

DHE探針標(biāo)記：
1．DHE 溶液可在新鮮培養(yǎng)液、緩沖鹽溶液或組織灌流液中稀釋到所需濃度，100～1000倍稀釋，以此染色液更換細(xì)胞培養(yǎng)液或灌流液；也可直接向細(xì)胞孵育液體或灌流液中加入DHE探針溶液至所需濃度。
2．依據(jù)細(xì)胞ROS含量的不同，DHE 終濃度可選擇在100-1000倍稀釋的范圍，孵育時(shí)間可選擇10～90分鐘，在37℃或室溫進(jìn)行避光孵育。
3．孵育結(jié)束后，用新鮮溶液清洗細(xì)胞或組織。

熒光顯微鏡檢測：
1．對(duì)貼壁生長細(xì)胞或活組織，可直接在熒光顯微鏡下觀察；對(duì)懸浮生長細(xì)胞，取25～50μl細(xì)胞懸液滴到一張顯微載玻片上，再蓋上一張蓋玻片。
2．熒光顯微鏡下，用藍(lán)光或綠光激發(fā)，觀察和拍攝細(xì)胞紅色發(fā)射圖像，ROS陽性細(xì)胞在整個(gè)核區(qū)被染成紅色；用紫外光激發(fā)時(shí)，胞漿中未氧化的二氫乙啶可發(fā)出藍(lán)色熒光。

流式細(xì)胞儀分析：
1．對(duì)貼壁生長細(xì)胞，用胰酶消化制備成單細(xì)胞懸液；對(duì)懸浮生長細(xì)胞，直接收集細(xì)胞。用0.5～1 ml 冰冷PBS 重懸細(xì)胞（5～10萬）。
2．采用480～535nm 波長激發(fā)，測定590nm～610nm 以上的發(fā)射，細(xì)胞應(yīng)可分成兩個(gè)亞群：ROS陰性細(xì)胞僅有很低的熒光強(qiáng)度，ROS陽性細(xì)胞有較強(qiáng)的紅色熒光。

特別提示：本公司的所有產(chǎn)品僅可用于科研實(shí)驗(yàn)，嚴(yán)禁用于臨床醫(yī)療及其他非科研用途！