活細(xì)胞/死細(xì)胞雙染試劑盒(Calcein-AM/PI)

中文名稱：活細(xì)胞/死細(xì)胞雙染試劑盒(Calcein-AM/PI)

英文名稱：Living/Dead cell double staining kit

產(chǎn)品規(guī)格：500T|1000T

活細(xì)胞/死細(xì)胞染色試劑盒是采用Calcein-AM/PI雙染細(xì)胞方法染色活細(xì)胞和死細(xì)胞。

Calcein-AM是一種可對(duì)活細(xì)胞進(jìn)行熒光標(biāo)記的細(xì)胞染色試劑，Calcein-AM由于在Calcein的基礎(chǔ)上加強(qiáng)了疏水性，因此能夠輕易穿透活細(xì)胞膜。當(dāng)其進(jìn)入到細(xì)胞質(zhì)后，酯酶會(huì)將其水解為Calcein留在細(xì)胞內(nèi)，發(fā)出強(qiáng)綠色熒光。與其它同類試劑(如BCECF-AM和Carboxy-fluorescein diacetate)相比，Calcein-AM是最適合作為熒光探針去染活細(xì)胞的，因?yàn)樗募?xì)胞毒性很低。Calcein的激發(fā)和發(fā)射波長(zhǎng)分別為490nm和515nm。
Calcein,AM僅對(duì)活細(xì)胞染色。作為核染色染料的PI不能穿過(guò)活細(xì)胞的細(xì)胞膜，它穿過(guò)死細(xì)胞膜的無(wú)序區(qū)域而到達(dá)細(xì)胞核，并嵌入細(xì)胞的DNA雙螺旋從而產(chǎn)生紅色熒光(激發(fā)：488,545nm，發(fā)射：617nm)，因此PI僅對(duì)死細(xì)胞染色。

由于Calcein和PI-DNA都可被490nm激發(fā)，因此可用熒光顯微鏡同時(shí)觀察活細(xì)胞和死細(xì)胞。用545nm激發(fā)，僅可觀察到死細(xì)胞。根據(jù)以上特點(diǎn)，Calcein,AM和PI經(jīng)常被結(jié)合用來(lái)作為活細(xì)胞和死細(xì)胞的雙重染色。

儲(chǔ)存條件：染色液A-20℃避光保存，避免反復(fù)凍融，染色液B和試劑C 2-8℃保存，有效期一年。

【注】：

• 長(zhǎng)期不用可以-20℃保存。
• 染色液Calcein AM注意防潮，避免反復(fù)凍融。
• 染色液A為DMSO溶液，冬季氣溫較低時(shí)在室溫時(shí)為凝固狀態(tài)，極易粘附在管壁、吸頭壁。注意需要加熱溶解，吸頭也需要放在培養(yǎng)箱預(yù)熱，否則容易再次凝固在吸頭內(nèi)壁產(chǎn)生損耗。融解后離心至管底部再打開(kāi)螺旋蓋。
• 注意需要加熱融解，變成液體狀態(tài)后離心至管底部再開(kāi)蓋?？梢杂檬治孀∈蛊淙诮饣?7℃短時(shí)間水浴。
• 試劑B溶解后需要用吸頭吹打混勻。

注意事項(xiàng)：

• 本試劑盒僅供科學(xué)研究使用，不可用于診斷或治療。
• 螺旋蓋微量試劑管裝的試劑在開(kāi)蓋前請(qǐng)短暫離心，將蓋和管內(nèi)壁上的液體離心至管底，避免開(kāi)蓋時(shí)試劑損失。
• 禁止與其他品牌的試劑混用，否則會(huì)影響使用效果。
• 樣品或試劑被細(xì)菌或真菌污染或試劑交叉污染可能會(huì)導(dǎo)致錯(cuò)誤的結(jié)果。
• 使用一次性吸頭、管、瓶或玻璃器皿，可重復(fù)使用的玻璃器皿必須在使用前清洗并徹底清除殘留清潔劑。
• 避免皮膚或粘膜與試劑接觸。

試劑盒以外自備試劑和儀器：
● PBS ● 純水● 移液器及吸頭●離心機(jī)●熒光顯微鏡或激光共聚焦或流式細(xì)胞儀

使用注意事項(xiàng)：

• 螺旋蓋微量試劑管裝的試劑在開(kāi)蓋前請(qǐng)短暫離心，將蓋內(nèi)壁上的液體收集至管底，避免開(kāi)蓋時(shí)液體灑落。
• 染色液A為DMSO溶液，冬季氣溫低時(shí)在室溫時(shí)為凝固狀態(tài)，極易粘附在管壁、吸頭壁。注意需要加熱溶解，吸頭也需要放在培養(yǎng)箱預(yù)熱，否則容易再次凝固在吸頭內(nèi)壁產(chǎn)生損耗。溶解后離心至管底部再打開(kāi)螺旋蓋。
• 試劑A為了便于觀察防止誤操作導(dǎo)致?lián)p失，在試劑盒中時(shí)是采用透明管包裝，收到后可以離心移入干燥黑色避光密封管或者用鋁箔包裹避光。
• 細(xì)胞處理需要小心操作，盡量避免人為的損傷細(xì)胞。
• 由于Calcein-AM的工作液穩(wěn)定性比較差，染色工作液必須現(xiàn)配現(xiàn)用，并且當(dāng)天用完。
• Calcein-AM對(duì)濕度非常敏感，若是Calcein-AM溶液每次取完需要量后，必須緊緊密封蓋子。建議根據(jù)單次用量，分裝密封保存。不可使用含水吸頭。
• 試劑A母液請(qǐng)擰緊螺旋蓋，避免受潮失效。
• 可以使用以下方法來(lái)優(yōu)化得到兩種熒光染料的工作濃度。
  1)用0.1皂素或者0.1-0.5%地高辛孵育細(xì)胞10min，或者用70%乙醇孵育細(xì)胞30min，從而制備死細(xì)胞。
  2)用15000倍-1500倍稀釋(試劑盒中的母液)的PI溶液進(jìn)行死細(xì)胞染色，以得到僅僅對(duì)細(xì)胞核染色，而不會(huì)對(duì)細(xì)胞質(zhì)染色的工作濃度。
  3)用1000倍-100倍稀釋(試劑盒中的母液)的Calcein-AM進(jìn)行活細(xì)胞染色，以得到不會(huì)對(duì)細(xì)胞質(zhì)染色的工作濃度。然后用此濃度進(jìn)行活細(xì)胞染色，去觀察是否活細(xì)胞能被染色。

使用方法：

• 染色工作液的配制：
  根據(jù)樣品數(shù)按下列比例配制染色工作液。
  用染料稀釋液試劑C將染色液A和B分別10倍稀釋。
  每10ml HBSS緩沖液或無(wú)血清培養(yǎng)基中加入100μl稀釋過(guò)的染色液A，充分混勻，即成染色工作液A。
  每10ml HBSS緩沖液或無(wú)血清培養(yǎng)基中加入5-50μl稀釋過(guò)的染色液B，充分混勻，即成染色工作液B。
  【注】
  • 由于不同細(xì)胞系的染色條件不同，初次實(shí)驗(yàn)建議做梯度試驗(yàn)，以確定Calcein-AM和PI的最適濃度。梯度篩選的原則為使用最低的探針濃度得到的熒光效果。Calcein-AM染色時(shí)間一般15-30分鐘，PI染色時(shí)間一般1-5分鐘。
  • 一般細(xì)胞Calcein-AM染色終濃度為試劑盒中母液的1000倍稀釋即可，個(gè)別細(xì)胞可能需要提高濃度至500倍稀釋或者延長(zhǎng)染色時(shí)間。PI的使用終濃度為試劑盒中母液的5000-30000倍稀釋，常用10000-20000倍。
  • Calcein-AM溶液和PI溶液可以分開(kāi)進(jìn)行染色，先用Calcein-AM染色，再用PI染色，也可以混合在一起同時(shí)染色。分開(kāi)染色。
  • 如果Calcein-AM溶液和PI溶液同時(shí)染色時(shí)，可以將Calcein-AM溶液和PI溶液根據(jù)預(yù)實(shí)驗(yàn)的終濃度同時(shí)加入無(wú)血清培養(yǎng)基或HBSS緩沖液中，配成一種染色工作液。注意PI的濃度在染上色的前提下盡可能低，否則可能有細(xì)胞毒性，使原本的活細(xì)胞上色。
  • 可以不用本試劑盒的染料稀釋液，直接用HBSS、無(wú)血清培養(yǎng)基配染色工作液。不可以用含血清培養(yǎng)基配制。
  • Calcein-AM染色工作液必須現(xiàn)配現(xiàn)用，并且在當(dāng)天用完。
• 收集樣本細(xì)胞。
• 用PBS洗滌細(xì)胞兩次。
  【注】
  • 由于培養(yǎng)箱中的血清等含有脂酶，導(dǎo)致Calcein-AM遇水會(huì)分解，導(dǎo)致空白上升，所以需要用PBS洗滌數(shù)次直至完全洗凈。
  • 貼壁細(xì)胞可以原位染色，注意吸除培養(yǎng)基前用培養(yǎng)板離心機(jī)離心，防止丟掉漂浮的死細(xì)胞。PBS洗滌時(shí)也需要離心培養(yǎng)板。
• 用200μl染色工作液將細(xì)胞重懸。
  【注】
  • Calcein-AM溶液和PI溶液可以分開(kāi)進(jìn)行染色，先用Calcein-AM染色，再用PI染色，也可以混合在一起同時(shí)染色。分開(kāi)染色。
  • 有時(shí)候可添加一定量的非離子表面活性劑如Pluronic F127到Calcein-AM內(nèi)來(lái)增強(qiáng)其水溶性。制備染色工作液前，取一管需要用的Calcein-AM內(nèi)加入20% Pluronic F127，使Pluronic F127的終濃度為0.02%。
  • 含Pluronic F127的Calcein-AM溶液不可長(zhǎng)期保存，現(xiàn)配現(xiàn)用。
• 在室溫或37℃避光孵育15-30分鐘。
  【注】
  • 如果分開(kāi)染色，Calcein-AM染色15-30分鐘，PI染色1-5分鐘即可。
  • 同時(shí)染色時(shí)，一定要注意PI濃度，防止染色活細(xì)胞。
  • 如果細(xì)胞本身含有有機(jī)陰離子轉(zhuǎn)運(yùn)體，需加入丙磺舒(Probenecid，1-2.5mM)或者苯磺唑酮(Sμlfinpyrazone，0.1-0.25mM)到孵育體系內(nèi)以降低染料Calcein泄露到胞外。
• 用PBS洗滌細(xì)胞。
  【注】
  • 如有必要，使用含有陰離子轉(zhuǎn)運(yùn)抑制劑的緩沖液來(lái)進(jìn)行細(xì)胞清洗。
• 用適量PBS重懸細(xì)胞。
• 用流式細(xì)胞儀或熒光顯微鏡檢測(cè)結(jié)果。激發(fā)為490nm，發(fā)射波長(zhǎng)分別為515nm和617nm。
  【注】
  • 在熒光顯微鏡下觀察時(shí)，如果背景高，可以用培養(yǎng)基再次清洗掉細(xì)胞外的染料后再觀察。

結(jié)果分析：
熒光顯微鏡下，使用488nm波長(zhǎng)激發(fā)，活細(xì)胞為黃綠色，死細(xì)胞為紅色。
用545nm波長(zhǎng)激發(fā)，僅能夠看到紅色的死細(xì)胞。

特別提示：本公司的所有產(chǎn)品僅可用于科研實(shí)驗(yàn)，嚴(yán)禁用于臨床醫(yī)療及其他非科研用途！