FITC-Annexin V/PI 細(xì)胞凋亡試劑盒 

產(chǎn)品貨號：F6012L 

產(chǎn)品規(guī)格：100T 

產(chǎn)品內(nèi)容：

儲存條件：

4℃避光冷藏，請勿凍存。有效期見外包裝。

光譜特性：

FITC-Annexin V: Ex/Em = 494/518 nm 

PI: Ex/Em = 535/617 nm (with DNA)

產(chǎn)品介紹：

FITC-Annexin V/PI凋亡試劑盒提供了一種快速簡便的方法，通過標(biāo)記早期凋亡細(xì)胞（綠色）和壞死或晚期凋亡的細(xì)胞 （紅色）檢測細(xì)胞凋亡水平。產(chǎn)品可以使用流式細(xì)胞儀或其它熒光檢測設(shè)備進行檢測。 

Annexin V（膜聯(lián)蛋白-V）是一種分子量為 35-36KD 的 Ca2+依賴性磷脂結(jié)合蛋白，可于磷脂酰絲氨酸（PS）選擇性結(jié)合。 磷脂酰絲氨酸（PS）主要分布在細(xì)胞膜內(nèi)側(cè)，即與細(xì)胞漿相鄰的一側(cè)。在細(xì)胞發(fā)生凋亡的早期，不同類型的細(xì)胞都會把磷脂 酰絲氨酸外翻到細(xì)胞表面，暴露在細(xì)胞外環(huán)境中。此時，使用綠色熒光探針 FITC 標(biāo)記的 Annexin V，即 FITC - Annexin V， 與外翻的磷脂酰絲氨酸（PS）結(jié)合，就可用流式細(xì)胞儀或熒光顯微鏡直接檢測到磷脂酰絲氨酸的外翻這一細(xì)胞凋亡的重要特 征。對于壞死或晚期凋亡的細(xì)胞，由于細(xì)胞完整性已經(jīng)被破壞，FITC - Annexin V 則可以進入胞漿與處于磷脂層內(nèi)側(cè)的 PS 結(jié)合，從而也使壞死細(xì)胞呈現(xiàn)綠色熒光。 

碘化丙啶（Propidium Iodide, PI）是一種 DNA 結(jié)合染料，它可以染色壞死細(xì)胞或凋亡晚期喪失細(xì)胞膜完整性的細(xì)胞的細(xì) 胞核。PI 可以由 488、532 或 546 nm 的激光激發(fā)，呈現(xiàn)紅色熒光。

使用方法：

1. 實驗設(shè)計：

空白管：陰性對照組細(xì)胞，不加FITC-Annexin V/PI。用于調(diào)節(jié)電壓。

單染管：陽性對照組細(xì)胞，只加FITC-Annexin V/只加PI。用于調(diào)節(jié)補償。

檢測管：處理的細(xì)胞，加FITC-Annexin V/PI。用空白管和單染管調(diào)節(jié)好電壓補償后，獲得所需要的流式數(shù)據(jù)。 

2. 收集細(xì)胞：

(1) 對于懸浮細(xì)胞：

a. 在進行完細(xì)胞凋亡刺激后，1000 rpm離心5 min，棄上清，收集細(xì)胞，用PBS輕輕重懸細(xì)胞并計數(shù)。 注：PBS重懸不能省略，PBS重懸的過程同時也起到了洗滌細(xì)胞的作用，可以保證后續(xù) FITC-Annexin V的結(jié)合。 

b. 取5×104 -1×105個重懸的細(xì)胞，1000 rpm離心5 min，棄上清，加入100 μL 1×Annexin V 結(jié)合緩沖液輕輕重懸細(xì)胞。 

c. 加入5 μL FITC-Annexin V，輕輕混勻。 

d. 加入5 μL PI染色液，輕輕混勻。 

e. 室溫 ( 20-25oC ) 避光孵育10 - 15 min?？梢允褂娩X箔進行避光。孵育過程中可以重懸細(xì)胞2-3次以改善染色效果。

(2) 對于貼壁細(xì)胞：

a. 把細(xì)胞培養(yǎng)液吸出至一合適離心管內(nèi)，PBS洗滌貼壁細(xì)胞一次，加入適量胰酶細(xì)胞消化液(不含EDTA)消化細(xì)胞。室溫孵育 至輕輕吹打可以使貼壁細(xì)胞吹打下來時，吸除胰酶細(xì)胞消化液。需避免胰酶的過度消化。 注：對于貼壁細(xì)胞，胰酶消化步驟很關(guān)鍵。胰酶消化時間如果過短，細(xì)胞需要用力吹打才能脫落，容易造成細(xì)胞膜的損傷， 從而導(dǎo)致細(xì)胞壞死的假陽性；消化時間如果過長，同樣易造成細(xì)胞膜損傷而出現(xiàn)細(xì)胞壞死的假陽性，甚至?xí)绊懠?xì)胞膜上磷 脂酰絲氨酸與FITC-Annexin V的結(jié)合從而干擾對于細(xì)胞凋亡的檢測。 

b. 加入上步中收集的細(xì)胞培養(yǎng)液，把細(xì)胞輕輕吹打下來，轉(zhuǎn)移到離心管內(nèi)，1000 rpm離心5 min，棄上清，收集細(xì)胞，用PBS 輕輕重懸細(xì)胞并計數(shù)。 注：加入上步中的細(xì)胞培養(yǎng)液非常重要，一方面可以收集已經(jīng)懸浮的發(fā)生凋亡或壞死的細(xì)胞，另一方面細(xì)胞培養(yǎng)液中的血清 可以有效抑制或中和殘留的胰酶。殘留的胰酶會消化并降解后續(xù)加入的 FITC-Annexin V，導(dǎo)致染色失敗。 

c. 取5×104 -1×105個重懸的細(xì)胞，1000 rpm離心5 min，棄上清，加入100 μL 1×Annexin V 結(jié)合緩沖液輕輕重懸細(xì)胞。 

d. 加入5 μL FITC-Annexin V，輕輕混勻。 

e. 加入5 μL PI染色液，輕輕混勻。 

f. 室溫 (20-25oC )避光孵育10 - 15 min。可以使用鋁箔進行避光。孵育過程中可以重懸細(xì)胞2-3次以改善染色效果。 

3. 結(jié)果分析：

(1) 流式細(xì)胞儀檢測：

a. 孵育完成后，可直接加入400 μL 1×Annexin V 結(jié)合緩沖液重懸細(xì)胞，立即上機檢測， FITC-Annexin V 由488 nm激光激 發(fā)，檢測熒光發(fā)射光譜在530 nm處（FITC 通道），PI通道發(fā)射光譜約在617 nm處。

b. 在雙變量流式細(xì)胞儀的散點圖上，左下象限顯示活細(xì)胞，為（FITC-Annexin V-/PI-）；右下象限為早期凋亡細(xì)胞，為（FITCAnnexin V+/PI-）；右上象限是壞死與晚期凋亡細(xì)胞，為（FITC-Annexin V+/PI+）；左上象限顯示裸核細(xì)胞，為（FITC-Annexin  V-/PI+)。 

(2) 熒光顯微鏡檢測：

a. 1000 rpm離心5 min，收集細(xì)胞，用400 μL 1×Annexin V 結(jié)合緩沖液輕輕重懸細(xì)胞。將細(xì)胞移至96孔板中沉降片刻或進行 細(xì)胞涂片后，置于熒光顯微鏡下觀察。 

b. FITC-Annexin V 可用 FITC適用的濾光片，PI可用 Cy3 或者 Texas適用的濾光片。

注意事項：

1. 使用前請將產(chǎn)品瞬時離心至管底，再進行后續(xù)實驗。 

2. 為降低細(xì)胞凋亡進程，孵育過程可在冰上操作，但孵育時間至少延長至 30 min。 

3. 由于細(xì)胞凋亡是一個快速的過程，建議樣品在染色后 1 h 之內(nèi)進行分析。 

4. 對于貼壁細(xì)胞，消化是一個關(guān)鍵步驟。貼壁細(xì)胞誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡時如有漂浮細(xì)胞，需收集漂浮細(xì)胞和貼壁細(xì)胞后合并染色。 處理貼壁細(xì)胞時要小心操作，盡量避免人為的損傷細(xì)胞。胰酶消化時間過短，細(xì)胞需要用力吹打才能脫落，容易造成細(xì)胞膜 的損傷，PI 攝入過多；消化時間過長，細(xì)胞膜同樣易造成損傷，甚至?xí)绊懠?xì)胞膜上磷脂酰絲氨酸與 FITC-Annexin V 的結(jié) 合。消化時將胰酶鋪滿孔板底后，輕搖時胰酶與細(xì)胞充分接觸，然后倒掉大部分胰酶，利用剩余的少量胰酶再消化一段時間， 待細(xì)胞間空隙增大，瓶底呈花斑狀即可終止。在消化液中盡量不用 EDTA，EDTA 會影響 Annexin V 與 PS 的結(jié)合。 

5. 貼壁細(xì)胞用胰蛋白酶消化后，建議在最佳培養(yǎng)條件和培養(yǎng)基中恢復(fù)約 30 min 后染色，避免假陽性。 

6. 為了避免洗滌細(xì)胞時損失細(xì)胞，在吸液時可以用大的 Tip 頭套上小的 Tip 頭吸液。 

7. 染料的最佳使用濃度由具體實驗要求確定。 

8. 熒光染料均存在淬滅問題，保存和使用過程中請盡量注意避光，以減緩熒光淬滅。 

9. 為了您的安全和健康，請穿實驗服并戴一次性手套操作。