RNAeasy™ Plus動物RNA抽提試劑盒(離心柱式)

的離心柱式RNAeasy™ Plus動物RNA抽提試劑盒(RNAeasy™ Plus Animal RNA Isolation Kit with Spin Column)是一種基于離心柱法從動物組織或培養(yǎng)的動物細胞中安全、快速、便捷、穩(wěn)定、高效、高質量地抽提總RNA的試劑盒?？俁NA包括大于200個核苷酸的RNA(也常被稱為總RNA)和小于200個核苷酸的小RNA(small RNA)。
本試劑盒抽提得到的RNA可用于反轉錄、RT-PCR、qPCR、Northern、點雜交(Dot Blot)、純化mRNA、體外翻譯、RNase protection assay、cDNA克隆等下游實驗；也可用于基因表達芯片分析(microarray)、高通量測序(high throughput sequencing)等對RNA質量要求較高的情況。
信裕生物的三款離心柱式及Trizol法RNA抽提試劑盒的主要特點和差異如下：

動物組織或細胞中的RNA按照長度可以分為長鏈RNA(long RNA)和小RNA(small RNA)，長鏈RNA通常大于200nt，而小RNA通常小于200nt。長鏈RNA按照是否編碼蛋白或多肽可以分為長鏈非編碼RNA(long noncoding RNA, lncRNA)和mRNA。小RNA主要包括非編碼的5.8S rRNA(ribosomal RNA)、5S rRNA、tRNA(transfer RNA)、microRNA(miRNA)、siRNA(small interfering RNA)、piRNA(Piwi-associated small RNA)、tsRNA(tRNA-derived small RNA)、srRNA(small rDNA-derived RNA)等。
本試劑盒抽提總RNA的基本流程如圖1所示。樣品在裂解液中迅速裂解，釋放出總RNA與小RNA，通過兩次特異性結合體系過同一純化柱，分別結合>200nt的RNA和<200nt的小RNA，同時有效避免了雜質大量析出而阻塞純化柱，抽提得到包括>200nt的RNA和小RNA的總RNA，基因組DNA和蛋白等雜質被有效去除，然后通過洗滌去除非特異性結合的蛋白等雜質，最后用洗脫液將總RNA洗脫下來。

圖1. 離心柱式總RNA(>200nt的RNA和<200nt的小RNA)抽提流程示意圖

本試劑盒使用安全。本試劑盒通過特殊的柱純化介質進行總RNA分離純化，能有效避免傳統的Trizol法抽提時使用的酚、氯仿等有毒有害有機試劑。
本試劑盒使用快速、便捷。本試劑盒采用柱純化，無需繁瑣的RNA沉淀步驟，抽提操作過程僅25-30分鐘。相比于傳統的Trizol抽提法，本試劑盒的操作流程顯著簡化，縮短了抽提時間，降低了RNA降解的風險。
本試劑盒抽提總RNA的得率高。本試劑盒的抽提效果經反復測試，100萬個凍存的HeLa細胞能抽提得到約15-20μg總RNA，5mg凍存的小鼠肝組織能抽提得到約6-10μg總RNA，5mg凍存的小鼠腎組織能抽提得到約3-5μg總RNA。不同來源的樣品可能有所差異，通常新鮮樣品的得率高于凍存樣品。本試劑盒的抽提效果參見圖2。

圖2. 本試劑盒總RNA抽提效果。樣品為凍存的50萬個HeLa細胞、5mg小鼠肝組織和5mg小鼠腎組織。洗脫液用量均為40μl。均取6μl洗脫的樣品經變性處理后，在含6.67%甲醛和適量NA-Red的1.2%變性瓊脂糖凝膠中電泳約45分鐘后拍照。抽提產物的得率依次為9.6μg、8.5μg和4.1μg，A260/A280依次為2.11、2.10和2.09，A260/A230依次為2.01、1.98和1.94。實際抽提效果會因實驗條件、檢測儀器等的不同而存在差異，本圖僅供參考。

注：純的RNA其A260/A280約為2.0，但在很多儀器上測定時會高于2.0，低于1.9通常認為有蛋白、DNA或者酚等的污染；純的RNA其A260/A230約為2.0左右或者略高，低于1.9通常認為有碳水化合物、胍鹽、多肽或酚等的污染。
本試劑盒抽提得到的總RNA純度高，顯著優(yōu)于Trizol方法。抽提得到的總RNA的A260/A280通常為2.0-2.2。A260/A230通常為1.9-2.1。本試劑盒抽提獲得的RNA的實測純度參見圖2。
本試劑盒適用于新鮮或凍存的動物組織或細胞總RNA與小RNA的抽提，推薦的細胞用量為50-100萬，組織用量為3-5mg。
本試劑盒可用于50個樣品的總RNA(含小RNA)抽提。
包裝清單：

保存條件：
室溫保存，一年有效。
注意事項：
對于富含RNase的樣品(如動物組織)，建議使用前在裂解液中添加二硫蘇糖醇(Dithiothreitol, DTT)至終濃度為40mM (例如1ml裂解液中加入20μl 2M DTT)或β-巰基乙醇至終濃度為1% (如1ml裂解液中加入10μl β-巰基乙醇)，含DTT或β-巰基乙醇的裂解液可在室溫放置1個月。
通過本試劑盒抽提到的RNA已經去除絕大多數DNA，通常情況無需DNase處理。后續(xù)如進行某些對極少量DNA殘留較敏感的實驗，則需要在使用說明中步驟5離心后，在純化柱中加入適量DNase I (如80μl含10U DNase I的酶溶液，推薦使用信裕生物的DNase I，D7076)，室溫消化15分鐘。消化結束后，不要離心，直接加入500μl洗滌液II，進入使用說明的步驟6進行操作。
本試劑盒提供的所有試劑和耗材都是RNase-free，操作時應小心，避免被污染。所有自行準備的試劑和耗材也都應是RNase-free。如果可能有RNase污染，可考慮用0.01%的DEPC水浸泡過夜，然后高溫高壓滅菌并烘干。操作時應避免對著樣品或所使用的試劑盒耗材呼氣或說話，以防RNase污染。建議戴一次性口罩操作。
對于操作環(huán)境中RNA酶的去除，推薦使用信裕生物生產的RNase and DNase Away (R0123)以去除實驗桌面上或其它接觸面上的RNase。
使用凍存的細胞或組織抽提RNA的效果通常比新鮮的細胞或組織差一些。因為在細胞或組織凍融過程中一些細胞或組織內的RNase會被釋放出來并剪切樣品中的RNA。對于組織樣品，推薦使用信裕生物生產的RNALater™動物組織RNA穩(wěn)定保存液(R0118)進行保存以保證樣品RNA的完整性。 
本試劑盒所有操作均在室溫進行，操作時無需冰浴。所有離心也均在室溫進行。 
廢液收集管在一次抽提中需多次使用，切勿中途丟棄。 
結合液I、II和洗滌液II中含有乙醇，使用后須旋緊瓶蓋以防揮發(fā)，并須按照易燃試劑的相關規(guī)范進行存放和使用。 
本產品僅限于專業(yè)人員的科學研究用，不得用于臨床診斷或治療，不得用于食品或藥品，不得存放于普通住宅內。 
為了您的安全和健康，請穿實驗服并戴一次性手套操作。
使用說明：
1.實驗材料的準備，與樣品的裂解。
細胞樣品：收集50-100萬左右的細胞。對于懸浮細胞，1000-2000g離心1分鐘后棄上清，加入300μl裂解液，輕輕吹打8-10次至固懸物溶解、溶液澄清；對于貼壁細胞，吸凈培養(yǎng)液后加入300μl裂解液，輕輕吹打5-10次至固懸物溶解、溶液澄清，轉移至一潔凈離心管內。
組織樣品：取3-5mg動物組織，置于液氮中研磨成粉末，立即加入300μl裂解液。也可將組織置于1.5ml離心管中，迅速加入300μl裂解液，用微型電動勻漿器勻漿，或者用普通玻璃勻漿器進行勻漿。研磨或勻漿后，輕輕吹打勻漿液8-10次，室溫放置3-5分鐘。然后約14,000g離心2分鐘，將上清液移至新的離心管中。對于比較容易裂解且勻漿很充分的組織(如肝組織、腦組織等)可以不用高速離心而直接進入步驟2。
注意：細胞的數量一般不超過200萬，動物組織的用量一般不超過10mg，用量過多可能會因裂解不充分導致得率下降。如果裂解后仍有粘稠物，需增加吹打次數至溶液完全澄清。對于富含RNase的樣品，裂解液中宜添加DTT至終濃度為40mM或添加β-巰基乙醇至終濃度為1%。
2.加入300μl結合液I至裂解液中，輕輕顛倒混勻3-5次。此時可能會有沉淀物產生，屬于正?，F象。
3.將混合物(包括沉淀物)轉移至純化柱內，12,000g離心30秒，回收收集管內液體至一新的1.5ml離心管。 
注意：對于一些特殊的樣品，如出現溶液未完全通過時，可延長離心時間至1-2分鐘，或者加大離心力至16,000g。對于一些能快速啟動達到12,000g的離心機，離心30秒已經足夠，對于一些啟動速度緩慢的離心機本步驟及后續(xù)步驟中的30秒離心宜調整為60秒。
4.向回收的液體中加入700μl結合液II，混勻后，將混合物(包括沉淀物)分兩次通過上一步的純化柱，每次12000g離心30秒后倒棄收集管內液體。
注意：加入結合液II后溶液總體積超過純化柱的容量(約750μl)，因此須分成2次過柱，即將一半的混合物(約650μl)加入純化柱內后12000g離心30秒，倒棄收集管內液體，再將剩余的混合物加入純化柱內12000g離心30秒，并倒棄收集管內液體。
5. 加入600μl洗滌液I，12,000g離心30秒，倒棄收集管內液體。
6.加入600μl洗滌液II，12,000g離心30秒，倒棄收集管內液體。
7.重復步驟6一次。
8.最高速(約14,000-16,000g)離心2分鐘，去除殘留的液體。
9.將RNA純化柱置于一新的本試劑盒中提供的1.5ml RNase-free離心管上，加入30-50μl洗脫液，室溫放置2-3分鐘，最高速離心30秒，所得溶液即為純化的總RNA。 
注意：洗脫液需要加到純化柱柱面中央，使其被完全吸收。如需獲得更高濃度的樣品，可把洗脫液的體積減小至20μl，但洗脫下來的總RNA量會相對減少。室溫較低時，洗脫液在37℃預熱片刻對得率有所幫助。此外，洗脫后的溶液再次加回到原純化柱再離心洗脫一次，可提高得率約10-30%；或者在次洗脫后使用新的洗脫液再洗脫一次，會獲得約為次洗脫量15-35%的RNA。