基因組DNA小量抽提試劑盒(離心柱式)

信裕生物的基因組DNA小量抽提試劑盒(離心柱式)(Genomic DNA Mini Preparation Kit with Spin Column)是目前世界上的基因組DNA抽提試劑盒之一?？梢猿樘釀游锝M織、鼠尾、培養(yǎng)細胞、細菌、酵母、動物血液、昆蟲以及固定組織的包括基因組DNA在內(nèi)的總DNA。一個試劑盒通過說明書中提供的不同操作方法，可以抽提除植物樣品外的幾乎所有樣品中的總DNA。
樣品首先被蛋白酶K消化，隨后加入適合DNA結合到純化柱上的緩沖液，然后加入到純化柱內(nèi)。通過高速離心，使DNA在穿過純化柱的瞬間，結合到純化柱上，隨后通過兩次洗滌去除各種雜質(zhì)，最后通過洗脫液把DNA洗脫下來。整個過程無需酚氯仿抽提，無需酒精沉淀，樣品裂解后僅需約15分鐘即可完成。
通過本試劑盒純化得到的基因組DNA的長度最長可達50kb左右，平均為30kb左右，最短為100bp的DNA也可以被純化。如需獲得更長的基因組DNA，對于哺乳動物樣品，包括組織或細胞等，可以使用信裕生物生產(chǎn)的(D0061)哺乳動物基因組DNA抽提試劑盒。
通過本試劑盒獲得的總DNA，OD260/OD280的范圍通常在1.7至1.9之間。
本試劑盒可以抽提少至數(shù)百個細胞，多至25mg組織、0.5-1cm鼠尾、500萬個培養(yǎng)細胞、20億個細菌或5000萬個酵母。樣品用量過多，反而會影響抽提效果。如果待抽提樣品的DNA含量小于5ng，建議加入適當量的carrier DNA，例如poly-dT或其它對后續(xù)實驗沒有干擾的DNA，也可以加入適當量的carrier RNA，例如yeast RNA等，以改善抽提效果。
本試劑盒的標準操作步驟抽提得到的總DNA會含有少量RNA，但如果按照可選步驟加入RNase A，就可以獲得不含RNA的高純度總DNA。含有RNA的總DNA可以用于PCR，但對于某些其它的后續(xù)反應可能會產(chǎn)生一些影響。
純化柱對于DNA的容量約為30微克。通常每200萬Hela細胞或500萬淋巴細胞可以抽提得到15-25微克總DNA，每25mg肝、腦、腎組織可以抽提得到10-30微克總DNA，每25毫克心、肺組織可以抽提得到5-10微克總DNA，每10mg脾組織可以抽提得到5-30微克總DNA，每1.2cm小鼠尾尖或0.3cm大鼠尾尖可以獲得10-25微克總DNA。
本試劑盒可以抽提50個樣品的總DNA。
包裝清單：

保存條件：
蛋白酶K-20℃保存，其余均室溫保存。一年有效。蛋白酶K室溫(15-25℃)存放一周，活力無明顯下降。
注意事項：
抽提細菌、酵母樣品時還需要一些特定的試劑，詳情請參考相關實驗步驟。
如需制備不含RNA的高純度總DNA，需自備RNase A。
溫度較低時樣品裂解液A或樣品裂解液B中可能會有沉淀產(chǎn)生，屬正?，F(xiàn)象。使用前必須檢查一遍。如有沉淀，55℃水浴孵育使沉淀溶解，混勻后使用。
次使用前洗滌液I需添加7ml無水乙醇，洗滌液II需添加24ml無水乙醇，混勻，并在瓶上做好標記。
本試劑盒需使用55℃水浴，請?zhí)崆白骱脺蕚洹?br /> 除特別說明外，每次Vortex應控制在5-10秒左右。
本試劑盒所有操作均在室溫進行，操作時無需冰浴。所有離心也均在室溫進行。
廢液收集管在一次抽提中需多次使用，切勿中途丟棄。
參考如下使用說明，從某些樣品中抽提總DNA不需要使用樣品裂解液A。 
本產(chǎn)品僅限于專業(yè)人員的科學研究用，不得用于臨床診斷或治療，不得用于食品或藥品，不得存放于普通住宅內(nèi)。
為了您的安全和健康，請穿實驗服并戴一次性手套操作。使用說明：
1. 從動物組織中提取總DNA
a．取不超過25mg的組織(脾不超過10mg)，剪切成盡可能小的碎片，加入180微升樣品裂解液A。
請勿使用過多的樣品，過多的樣品會導致抽提效果下降。較小的組織碎片會使裂解速度加快，裂解效果提高。新鮮或凍存的組織均可，但固定過的組織請參考后續(xù)的其它步驟進行。
b．加入20微升蛋白酶K，Vortex混勻，55℃水浴孵育至完全裂解。
在孵育期間可以偶爾取出樣品Vortex以加快裂解速度。裂解的時間因組織不同而有所不同，通?？稍?-3小時內(nèi)完成。為方便起見，可以直接裂解過夜，裂解過夜對抽提效果無任何負面影響。組織完全裂解后可以呈粘稠狀，但不應該呈可把DNA純化柱堵住的凝膠狀。如果消化過夜仍呈凝膠狀，說明樣品用量過多，作為補救措施，可以把整個反應體系放大一倍。
c．清除RNA(可選做)。如果希望獲得不含RNA的高純度總DNA，加入4微升100mg/ml       RNase A，Vortex混勻。室溫(15-25℃)放置2分鐘。
轉(zhuǎn)錄活性水平很高的組織例如肝和腎組織，RNA含量很高，在不做清除RNA的操作步驟(步驟1.c)的情況下，會導致最后獲得的總DNA含有小部分RNA。如果殘余的少量RNA對后續(xù)實驗沒有干擾，可以不進行本步實驗操作，直接進入步驟d。
d．最高速劇烈Vortex 15秒。加入200微升樣品裂解液B，Vortex混勻。70℃孵育10分鐘。
加入樣品裂解液B后需立即Vortex混勻。加入樣品裂解液B后可能會產(chǎn)生白色沉淀，但大多數(shù)情況在70℃孵育后會溶解。即使70℃孵育后仍有白色沉淀也不會干擾后續(xù)實驗。有些組織例如肺、脾，在加入樣品裂解液B后可能會形成凝膠狀物，此時需劇烈晃動或Vortex樣品，以盡量破壞凝
膠狀物。
e．加入200微升無水乙醇，Vortex混勻。
加入乙醇后必須充分混勻，否則會嚴重影響抽提效果。加入乙醇后可能產(chǎn)生白色沉淀，屬正?，F(xiàn)象，后續(xù)步驟中必須把白色沉淀和溶液全部轉(zhuǎn)移到純化柱內(nèi)。
f．把步驟e中的混合物加入到DNA純化柱內(nèi)。≥6000g(約≥8000rpm)離心1分鐘。倒棄廢液收集管內(nèi)液體。
進行本步驟前需將純化柱置于廢液收集管上。倒棄廢液后回收廢液收集管。
注意：必須把沉淀全部轉(zhuǎn)移到DNA純化柱內(nèi)，否則會嚴重影響抽提效果！
g．加入500微升洗滌液I，≥6000g(約≥8000rpm)離心1分鐘。倒棄廢液收集管內(nèi)液體。
進行本步驟前需將純化柱置于廢液收集管上。倒棄廢液后回收廢液收集管。
h．加入600微升洗滌液II，≥18000g(約≥12000rpm)離心1分鐘。倒棄廢液收集管內(nèi)液體。
進行本步驟前需將純化柱置于廢液收集管上。倒棄廢液后回收廢液收集管。
i．再≥18000g(約≥12000rpm)離心1分鐘，以去除殘留的乙醇。
不可把步驟h的離心時間延長而省略本步驟。倒棄廢液后再離心可以確保充分去除殘留的乙醇。
j．將DNA純化柱置于一潔凈的1.5ml離心管上，加入50-200微升洗脫液。室溫放置1-3分鐘。≥12000rpm離心1分鐘。所得液體即為純化得到的總DNA。
洗脫液需要直接加至純化柱管內(nèi)柱面中央，使液體被純化柱吸收。如果有必要，可以使用去離子水或TE進行洗脫。使用較小體積的洗脫液可以使獲得的總DNA的濃度較高，但洗脫下來的DNA量相對較少。如果對于獲得較多量的DNA非常重要，可以在次用200微升洗脫液洗脫后，再用200微升洗脫液重復洗脫一次。第二次洗脫可以增加產(chǎn)量10-80%，特別是當次洗脫下來的DNA大于10微克時，第二次洗脫可以獲得次洗脫時50-80%的量。一次性加入多于200微升的洗脫液對洗脫效果的改善相對不太明顯。
2. 從鼠尾中抽提總DNA
a．取0.4-0.6cm的大鼠尾尖一段，或小鼠尾尖最多兩段，加入180微升樣品裂解液A。
小鼠尾尖最長不能超過1.2cm，大鼠尾尖不能超過0.6cm。如果使用的是成年大鼠或小鼠，建議僅使用0.4-0.6cm長的尾尖。如果抽提鼠尾的DNA用genotyping，使用0.2-0.3cm長的尾尖已經(jīng)足夠。
b．加入20微升蛋白酶K，Vortex混勻，55℃水浴孵育至完全裂解。
在孵育期間可以偶爾取出樣品Vortex以加快裂解速度。并確保鼠尾浸沒在裂解液內(nèi)。裂解完全通常需6-8小時。為方便起見，可以直接裂解過夜，裂解過夜對抽提效果無任何負面影響。組織完全裂解后可以呈粘稠狀，但不應該呈可把DNA純化柱堵住的凝膠狀。如果消化過夜仍呈凝膠狀，說明樣品用量過多，作為補救措施，可以把整個反應體系放大一倍。
c．清除RNA(可選做)。如果希望獲得不含RNA的高純度總DNA，加入4微升100mg/ml RNase A，Vortex混勻。室溫(15-25℃)放置2分鐘。
鼠尾中RNA含量很低，但在不做清除RNA的操作步驟(步驟2.c)的情況下，會導致最后獲得的總DNA含有少量的RNA。如果殘余的少量RNA對后續(xù)實驗沒有干擾，可以不進行本步實驗操作，直接進入步驟d。
d．按照等體積混合適當體積的樣品裂解液B和無水乙醇，Vortex混勻。
每一個樣品，需混合200微升樣品裂解液B和200微升無水乙醇。如果有10個樣品，則需混合2ml樣品裂解液B和2ml無水乙醇，以此類推。配制好的樣品裂解液B和無水乙醇的等體積混合液，室溫放置，3個月內(nèi)有效。必須Vortex充分混勻，否則會嚴重影響抽提效果。
e．最高速劇烈Vortex 15秒。加入400微升步驟d配制的樣品裂解液B和無水乙醇等體積混合液，劇烈Vortex混勻。
加入樣品裂解液B和無水乙醇的等體積混合液后可能會產(chǎn)生白色沉淀，屬正?，F(xiàn)象，后續(xù)步驟中必須把白色沉淀和溶液全部轉(zhuǎn)移到純化柱內(nèi)，沉淀不會影響抽提效果。
f．把步驟e中的混合物加入到DNA純化柱內(nèi)。≥6000g(約≥8000rpm)離心1分鐘。倒棄廢液收集管內(nèi)液體。
進行本步驟前需將純化柱置于廢液收集管上。倒棄廢液后回收廢液收集管。
注意：必須把沉淀全部轉(zhuǎn)移到DNA純化柱內(nèi)，否則會嚴重影響抽提效果！
g．加入500微升洗滌液I，≥6000g(約≥8000rpm)離心1分鐘。倒棄廢液收集管內(nèi)液體。
進行本步驟前需將純化柱置于廢液收集管上。倒棄廢液后回收廢液收集管。
h．加入600微升洗滌液II，≥18000g(約≥12000rpm)離心1分鐘。倒棄廢液收集管內(nèi)液體。
進行本步驟前需將純化柱置于廢液收集管上。倒棄廢液后回收廢液收集管。
i．再≥18000g(約≥12000rpm)離心1分鐘，以去除殘留的乙醇。
不可把步驟h的離心時間延長而省略本步驟。倒棄廢液后再離心可以確保充分去除殘留的乙醇。
j．將DNA純化柱置于一潔凈的1.5ml離心管上，加入50-200微升洗脫液。室溫放置1-3分鐘。≥12000rpm離心1分鐘。所得液體即為純化得到的總DNA。
洗脫液需要直接加至純化柱管內(nèi)柱面中央，使液體被純化柱吸收。如果有必要，可以使用去離子水或TE進行洗脫。使用較小體積的洗脫液可以使獲得的總DNA的濃度較高，但洗脫下來的DNA量相對較少。如果對于獲得較多量的DNA非常重要，可以在次用200微升洗脫液洗脫后，再用200微升洗脫液重復洗脫一次。第二次洗脫可以增加產(chǎn)量10-80%，特別是當次洗脫下來的DNA大于10微克時，第二次洗脫可以獲得次洗脫時50-80%的量。一次性加入多于200微升的洗脫液對洗脫效果的改善相對不太明顯。
3. 從培養(yǎng)的動物細胞中抽提總DNA
a．收集最多不超過500萬的細胞，離心沉淀后重懸于200微升PBS中。
PBS需自備。如果使用凍存的細胞沉淀，先把細胞沉淀解凍，并輕輕彈散，然后再加入PBS。對于基因組DNA含量較高的細胞，例如Hela細胞，應使用較少的細胞，例如100-200萬Hela細胞。
b．清除RNA(可選做)。如果希望獲得不含RNA的高純度總DNA，加入4微升100mg/ml RNase A，Vortex混勻。室溫(15-25℃)放置2分鐘。
在不做清除RNA的操作步驟(步驟3.b)的情況下，會導致最后獲得的總DNA含有小部分RNA。如果殘余的少量RNA對后續(xù)實驗沒有干擾，可以不進行本步實驗操作，直接進入步驟c。
c．加入20微升蛋白酶K，Vortex混勻。
d．加入200微升樣品裂解液B，Vortex混勻。70℃孵育10分鐘。
加入樣品裂解液B后必須立即Vortex混勻。不可把蛋白酶K直接和樣品裂解液B混合。
e．加入200微升無水乙醇，Vortex混勻。
加入乙醇后必須充分混勻，否則會嚴重影響抽提效果。加入乙醇后可能會產(chǎn)生白色沉淀，屬正常現(xiàn)象，后續(xù)步驟中必須把白色沉淀和溶液全部轉(zhuǎn)移到純化柱內(nèi)。
f．把步驟e中的混合物加入到DNA純化柱內(nèi)。≥6000g(約≥8000rpm)離心1分鐘。倒棄廢液收集管內(nèi)液體。
進行本步驟前需將純化柱置于廢液收集管上。倒棄廢液后回收廢液收集管。
注意：必須把沉淀全部轉(zhuǎn)移到DNA純化柱內(nèi)，否則會嚴重影響抽提效果！
g．加入500微升洗滌液I，≥6000g(約≥8000rpm)離心1分鐘。倒棄廢液收集管內(nèi)液體。
進行本步驟前需將純化柱置于廢液收集管上。倒棄廢液后回收廢液收集管。
h．加入600微升洗滌液II，≥18000g(約≥12000rpm)離心1分鐘。倒棄廢液收集管內(nèi)液體。
進行本步驟前需將純化柱置于廢液收集管上。倒棄廢液后回收廢液收集管。
i．再≥18000g(約≥12000rpm)離心1分鐘，以去除殘留的乙醇。
不可把步驟h的離心時間延長而省略本步驟。倒棄廢液后再離心可以確保充分去除殘留的乙醇。
j．將DNA純化柱置于一潔凈的1.5ml離心管上，加入50-200微升洗脫液。室溫放置1-3分鐘。≥12000rpm離心1分鐘。所得液體即為純化得到的總DNA。
洗脫液需要直接加至純化柱管內(nèi)柱面中央，使液體被純化柱吸收。如果有必要，可以使用去離子水或TE進行洗脫。使用較小體積的洗脫液可以使獲得的總DNA的濃度較高，但洗脫下來的DNA量相對較少。如果對于獲得較多量的DNA非常重要，可以在次用200微升洗脫液洗脫后，再用200微升洗脫液重復洗脫一次。第二次洗脫可以增加產(chǎn)量10-80%，特別是當次洗脫下來的DNA大于10微克時，第二次洗脫可以獲得次洗脫時50-80%的量。一次性加入多于200微升的洗脫液對洗脫效果的改善相對不太明顯。
4. 從動物血液中抽提總DNA
本操作方法也適用于血沉棕黃層(buffy coat)和骨髓(bone marrow)的總DNA抽提。
a．取50-100微升紅細胞無細胞核的血，或5-10微升活細胞有細胞核的血。
人、猴、牛、兔、大鼠、小鼠等的紅細胞無細胞核，鳥、魚、蛙等的紅細胞有細胞核。紅細胞有細胞核會導致相同體積的血液內(nèi)DNA的含量非常高。
b．加入20微升蛋白酶K。
c．加入PBS至總體積為220微升，Vortex混勻。
d．加入200微升樣品裂解液B，Vortex混勻。70℃孵育10分鐘。
e．轉(zhuǎn)步驟3.e。后續(xù)步驟同“從培養(yǎng)的動物細胞中抽提總DNA”3.e起的步驟。
5. 從石蠟包埋的組織樣品中抽提總DNA
由于包埋的組織通常已經(jīng)被固定，通常僅能獲得長度小于650bp的DNA。乙醇或甲醛固定的石蠟包埋組織樣品相對比較適合DNA的抽提，而有交聯(lián)作用的固定試劑(例如鋨酸)固定的組織則不適合用于抽提DNA。需自備二甲苯。
a．取一塊小于25mg的包埋塊，加入1.2ml二甲苯，劇烈Vortex，以充分脫臘。
b．臺式離心機最高速(12000-14000rpm)室溫離心5分鐘，棄上清。
注意，去除上清的時候要非常小心，不要把沉淀丟失了。
c．加入1.2ml無水乙醇，輕輕Vortex混勻，以去除殘留的二甲苯。
d．臺式離心機最高速(12000-14000rpm)室溫離心5分鐘，棄上清。
注意，去除上清的時候要非常小心，不要把沉淀丟失了。
e．重復步驟c和d一次，即再用乙醇洗滌樣品一次。
f．棄上清后再最高速離心1分鐘，用20微升槍小心吸除殘留的液體。
g．室溫放置數(shù)分鐘至乙醇全部揮發(fā)。
h．加入180微升樣品裂解液A。
i．轉(zhuǎn)步驟1.b，后續(xù)步驟同“從動物組織中提取總DNA”1.b起的步驟。
6. 從甲醛固定的組織中抽提總DNA
由于組織已經(jīng)被固定，通常僅能獲得長度小于650bp的DNA。甲醛或乙醇固定的組織樣品相對比較適合DNA的抽提，而有交聯(lián)作用的固定試劑(例如鋨酸)固定的組織則不適合用于抽提DNA。乙醇固定的組織可以參考甲醛固定的組織的抽提方法進行總DNA的抽提。
a．取不超過25mg的組織，用PBS洗滌兩次，以充分去除固定液。
b．去除PBS，轉(zhuǎn)步驟1.a，后續(xù)步驟同“從動物組織中提取總DNA”1.a起的步驟。
7. 從革蘭氏陰性菌中抽提總DNA
a．離心收集最多不超過20億個細菌，棄上清。
b．加入180微升樣品裂解液A，充分重懸細菌。
c．轉(zhuǎn)步驟1.b，后續(xù)步驟同“從動物組織中提取總DNA”1.b起的步驟。
8. 從革蘭氏陽性菌中抽提總DNA
需自備溶菌酶，并配制溶菌酶溶液：20mM Tris，pH8.0，2mM EDTA，1.2% Triton X-100，20mg/ml溶菌酶。溶菌酶在臨使用前加入。
a．離心收集最多不超過20億個細菌，棄上清。
b．用180微升溶菌酶溶液充分重懸細菌。
c．37℃孵育30分鐘以裂解細菌。
d．加入20微升蛋白酶K，Vortex混勻。
e．加入200微升樣品裂解液B，Vortex混勻。
不可把蛋白酶K直接加入到樣品裂解液B中。
f．70℃孵育30分鐘。
g．轉(zhuǎn)步驟1.e，后續(xù)步驟同“從動物組織中提取總DNA”1.e起的步驟。
9. 從酵母中抽提總DNA
需自備用于裂解酵母的酶lyticase，并配制酵母裂解液：1M 山梨糖醇(sorbitol)，100mM EDTA，14mM 
a．離心收集最多不超過50萬個酵母，棄上清。
b．用600微升上述酵母裂解液重懸，加入200U lyticase，30℃孵育30分鐘。
注意：裂解的時間會隨酵母的種類不同而有所不同，詳細情況請參考lyticase的說明書。
c．300g離心10分鐘收集沉淀，棄上清。
d．沉淀用180微升樣品裂解液A重懸。
e．轉(zhuǎn)步驟1.b，后續(xù)步驟同“從動物組織中提取總DNA”1.b起的步驟。
10. 從昆蟲中抽提總DNA
a．用液氮冷凍后研碎處理：
a).取最多不超過50mg昆蟲(例如果蠅)，液氮冷凍后研碎，轉(zhuǎn)移至1.5ml離心管中。
b).加入180微升樣品裂解液A。
c).轉(zhuǎn)步驟1.b，后續(xù)步驟同“從動物組織中提取總DNA”1.b起的步驟。
b．用勻漿器勻漿處理：
a).取最多不超過50mg昆蟲(例如果蠅)。
b).加入180微升PBS，用電動勻漿器或玻璃勻漿器勻漿。
c).轉(zhuǎn)步驟3.b，后續(xù)步驟同“從培養(yǎng)的動物細胞中抽提總DNA”3.b起的步驟。
11. 從其它樣品中抽提總DNA
對于某些樣品需使用特定的裂解液裂解，可以參考如下方法進行總DNA的抽提。
a．樣品用200微升特定的裂解液裂解。裂解需確保呈溶液狀態(tài)，如果有不溶物需通過離心沉淀去除。
b．加入20微升蛋白酶K。
c．加入200微升樣品裂解液B，立即Vortex混勻。
d．70℃孵育10分鐘。
檢查整個溶液的pH值，確保pH值小于7.0，否則DNA結合到純化柱的效率會很低。
e．轉(zhuǎn)步驟1.e，后續(xù)步驟同“從動物組織中提取總DNA”1.e起的步驟。