BeyoFast™ SYBR Green qPCR Mix (2X, High ROX)

信裕生物的BeyoFast™ SYBR Green qPCR Mix (2X, High ROX)是一種用于實時熒光定量PCR，即qPCR (Quantitative PCR)或real-time PCR的高品質(zhì)預混液，主要用于cDNA和基因組DNA等的特異性超高靈敏度定量檢測。
BeyoFast™ SYBR Green qPCR Mix (2X, High ROX)使用SYBR Green I作為染料。SYBR Green I是一種結(jié)合于雙鏈DNA(double-strand DNA, dsDNA)雙螺旋小溝區(qū)域的綠色熒光染料。SYBR Green I在游離狀態(tài)下的熒光比較微弱，一旦與雙鏈DNA結(jié)合后，其熒光會大大增強。這樣通過檢測熒光強弱就可以定量檢測PCR過程中擴增產(chǎn)生的雙鏈DNA的數(shù)量。
本產(chǎn)品使用的BeyoFast™ Taq DNA Polymerase是一種與抗體結(jié)合的高品質(zhì)熱啟動酶，能夠?qū)崿F(xiàn)便捷高效的熱啟動。BeyoFast™ Taq DNA Polymerase中的Taq酶與抗Taq酶的單克隆抗體相互結(jié)合，從而抑制了Taq酶的DNA聚合酶活性，這樣可以有效避免在低溫條件下由引物和模板DNA非特異性退火或引物二聚體引起的非特異性擴增。在PCR反應的預變性步驟中抗體會被加熱失活，這樣可以確保僅在預變性后才會把Taq酶的活性釋放出來，預變性之前不會發(fā)生DNA聚合反應，從而大大提高了PCR反應的特異性、靈敏度和定量檢測的準確性。
本產(chǎn)品包含了BeyoFast™ Taq DNA Polymerase、PCR Buffer、dNTPs、SYBR Green I熒光染料、穩(wěn)定劑和鎂離子等所有的通用組分，使操作更簡單、使用更便捷。用戶只需自備引物、樣品DNA和去離子水即可。
本產(chǎn)品含高濃度ROX，適用于需高濃度ROX作為校正染料的熒光定量PCR儀。ROX的作用是用于校正與PCR無關(guān)的熒光波動，從而限度減少孔間差異。這種差異可能由多種因素引起，如移液誤差及樣品蒸發(fā)等。不同的熒光定量PCR儀對ROX的要求不同，請根據(jù)實際所用儀器選擇含高濃度ROX (High ROX)、低濃度ROX (Low ROX)或不含ROX的BeyoFast™ SYBR Green qPCR Mix (2X)。通常含高濃度ROX的BeyoFast™ SYBR Green qPCR Mix (2X, High ROX)也可以用于不需要ROX或需要低濃度ROX的熒光定量PCR儀。常用儀器所需ROX類型請參考如下表格。

本產(chǎn)品如果用于常規(guī)的96孔板qPCR檢測(建議反應體系為20μl)，每毫升本產(chǎn)品可以進行100次檢測；如果用于常規(guī)的384孔板qPCR檢測(建議反應體系為10μl)，每毫升本產(chǎn)品可以進行200次檢測。
包裝清單：

保存條件：
-20℃避光保存，一年有效； 4℃避光保存，一個月內(nèi)有效。盡量避免反復凍融。
注意事項：
使用前需確保整管試劑完全融化，上下顛倒輕輕混勻后使用?；靹蜻^程中盡量避免產(chǎn)生氣泡。
注意引物退火溫度，當退火溫度<60℃時，推薦使用三步法PCR擴增。
本產(chǎn)品中含有SYBR Green I熒光染料，保存本產(chǎn)品或設(shè)置PCR反應時應避免強光照射，以盡量避免熒光淬滅問題。
對于超過350bp或者高GC含量的擴增片段，建議增加延伸時間至60秒或者采用三步法以提高擴增效率。
經(jīng)測試，本產(chǎn)品反復凍融10次對使用效果無顯著影響。但仍需盡量避免反復凍融本產(chǎn)品，反復凍融可能使產(chǎn)品性能下降。

使用說明：
1. PCR反應體系的設(shè)置： 
a. 融解并混勻PCR反應所需的各種溶液。BeyoFast™ SYBR Green qPCR Mix (2X, High ROX)完全融解并混勻后置于冰浴上或冰盒內(nèi)。
b. 參考下表在室溫或冰浴上設(shè)置PCR反應體系(以96孔板為例)：

注意：(1) 通常引物的終濃度為0.2-0.5μM時可獲得良好的檢測效果，也可以根據(jù)情況在0.1-1.0μM范圍內(nèi)調(diào)整引物的終濃度。
(2) 通常DNA模板的量以1-10ng cDNA或10-100ng基因組DNA為參考用量。因不同物種的模板中含有的目的基因拷貝數(shù)不同，
如有必要，可對模板進行梯度稀釋，以確定的模板使用量。RT-PCR反應得到的cDNA直接作為模板時，其添加量不要超過PCR反應總體積的10%。
(3) 96孔板的推薦反應體系為20μl，也可以根據(jù)實際實驗需求，按比例擴大或縮小反應體系。
(4) 建議設(shè)置不加模板的陰性對照組。
c. 用移液器輕輕吹打混勻或輕微Vortex混勻，室溫離心數(shù)秒，使液體積聚于管底。
d. 將設(shè)置好的PCR反應管或PCR反應板置于熒光定量PCR儀上，開始PCR反應。
2. PCR反應程序：
在Real-time PCR反應前進行模板的預變性，通常設(shè)定為95℃ 2分鐘，復雜或高GC模板適當延長時間至5分鐘。本產(chǎn)品中的BeyoFast™ Taq DNA Polymerase可以在15秒內(nèi)可完成至少300bp的擴增，可以滿足絕大多數(shù)的qPCR實驗；對于超過350bp或者高GC含量的擴增子，建議增加延伸時間至60秒或者采用三步法以提高擴增效率。建議采用如下的PCR程序，本程序是以ABI 7900HT熒光定量PCR儀為例：
a. 預變性：95℃ 2min
b. 變性：95℃ 15sec
c. 退火/延伸：60℃ 15-30sec
d. 重復步驟b和步驟c，總共40個循環(huán)
e. 熔解曲線分析(可選)：95℃ 15sec, 60℃ 15sec, 95℃ 15sec
f. 使用熒光定量PCR儀提供的軟件分析結(jié)果
三步法只需在退火/延伸后加一步72℃ 30sec，隨后重復步驟b、c及增加的這一步驟共40個循環(huán)即可。
注：以上舉例為常規(guī)qPCR反應系統(tǒng)，僅供參考。實際反應條件因模板、引物等的結(jié)構(gòu)不同而各異，需根據(jù)模板、引物、目的片段的特點設(shè)定反應條件，并根據(jù)比例放大或縮小反應體系。

常見問題：
1. 熒光定量PCR結(jié)果不理想，出現(xiàn)特異性不好或擴增效率不高時，可能是由于以下原因造成：
a. 引物設(shè)計不佳。請選擇適當?shù)囊镌O(shè)計軟件進行引物設(shè)計，注意引物的GC含量、二級結(jié)構(gòu)、二聚體、退火溫度、長度、特異性等方面的問題。也可以嘗試使用有文獻報道使用過的引物，或者從信裕生物訂購經(jīng)過測試的qPCR引物。
b. 待擴增片段GC含量偏高。GC含量較高的情況下PCR會變得相對比較困難，此時宜更換引物。
c. PCR反應體系在室溫設(shè)置時容易導致非特異性條帶，但在使用熱啟動酶時可以有效避免室溫操作導致的非特異性條帶的產(chǎn)生。
但對于一些較難擴增的產(chǎn)物，可以嘗試在冰浴上設(shè)置PCR反應體系，以進一步減少非特異性的DNA擴增。
d. 退火溫度不佳，需要優(yōu)化。這種情況下宜更換引物。
e. 待擴增片段GC含量較高或長度較長，變性不夠充分。此時宜更換引物，使待擴增片段的GC含量和長度適中。
f. 模板量太低，此時宜適當加大模板量。
g. 模板中含有抑制PCR反應的物質(zhì)，可以用適當?shù)腄NA純化方法例如柱純化等純化模板DNA。
2. 反應條件優(yōu)化方法：
a. 引物濃度：通常引物終濃度為0.2-0.5μM時可獲得良好檢測效果，終濃度可以在0.1-1.0μM范圍內(nèi)適當調(diào)整。如果希望提高反
應特異性，可降低引物濃度；如果希望提高擴增效率，可增加引物的濃度，從而優(yōu)化反應體系。
b. 退火溫度：建議采用兩步法PCR，退火溫度60℃進行反應。如果希望提高反應特異性，可提高退火溫度，以60-64℃作為退
火溫度的調(diào)整范圍。在引物Tm值較低而得不到良好的實驗結(jié)果時，可嘗試進行三步法PCR擴增，三步法的退火溫度請以56-64℃作為溫度設(shè)置的參考范圍。
c. 延伸時間：建議采用兩步法PCR，延伸15-30秒。對于超過350bp或者高GC含量的擴增子，建議增加延伸時間至60秒或者采用
三步法以提高擴增效率。

qPCR檢測是超高靈敏度的檢測，PCR反應設(shè)置區(qū)域需盡量避免各種可能的待擴增產(chǎn)物的污染。PCR產(chǎn)物宜密封后丟棄，以避免超高濃度的PCR產(chǎn)物污染實驗環(huán)境。
本產(chǎn)品僅限于專業(yè)人員的科學研究用，不得用于臨床診斷或治療，不得用于食品或藥品，不得存放于普通住宅內(nèi)。
為了您的安全和健康，請穿實驗服并戴一次性手套操作。