BeyoFast™ SYBR Green qPCR Mix (2X, High ROX)

信裕生物的BeyoFast™ SYBR Green qPCR Mix (2X, High ROX)是一種用于實時熒光定量PCR，即qPCR (Quantitative PCR)或real-time PCR的高品質(zhì)預(yù)混液，主要用于cDNA和基因組DNA等的特異性超高靈敏度定量檢測。
BeyoFast™ SYBR Green qPCR Mix (2X, High ROX)使用SYBR Green I作為染料。SYBR Green I是一種結(jié)合于雙鏈DNA(double-strand DNA, dsDNA)雙螺旋小溝區(qū)域的綠色熒光染料。SYBR Green I在游離狀態(tài)下的熒光比較微弱，一旦與雙鏈DNA結(jié)合后，其熒光會大大增強。這樣通過檢測熒光強弱就可以定量檢測PCR過程中擴增產(chǎn)生的雙鏈DNA的數(shù)量。
本產(chǎn)品使用的BeyoFast™ Taq DNA Polymerase是一種與抗體結(jié)合的高品質(zhì)熱啟動酶，能夠?qū)崿F(xiàn)便捷高效的熱啟動。BeyoFast™ Taq DNA Polymerase中的Taq酶與抗Taq酶的單克隆抗體相互結(jié)合，從而抑制了Taq酶的DNA聚合酶活性，這樣可以有效避免在低溫條件下由引物和模板DNA非特異性退火或引物二聚體引起的非特異性擴增。在PCR反應(yīng)的預(yù)變性步驟中抗體會被加熱失活，這樣可以確保僅在預(yù)變性后才會把Taq酶的活性釋放出來，預(yù)變性之前不會發(fā)生DNA聚合反應(yīng)，從而大大提高了PCR反應(yīng)的特異性、靈敏度和定量檢測的準確性。
本產(chǎn)品包含了BeyoFast™ Taq DNA Polymerase、PCR Buffer、dNTPs、SYBR Green I熒光染料、穩(wěn)定劑和鎂離子等所有的通用組分，使操作更簡單、使用更便捷。用戶只需自備引物、樣品DNA和去離子水即可。
本產(chǎn)品含高濃度ROX，適用于需高濃度ROX作為校正染料的熒光定量PCR儀。ROX的作用是用于校正與PCR無關(guān)的熒光波動，從而限度減少孔間差異。這種差異可能由多種因素引起，如移液誤差及樣品蒸發(fā)等。不同的熒光定量PCR儀對ROX的要求不同，請根據(jù)實際所用儀器選擇含高濃度ROX (High ROX)、低濃度ROX (Low ROX)或不含ROX的BeyoFast™ SYBR Green qPCR Mix (2X)。通常含高濃度ROX的BeyoFast™ SYBR Green qPCR Mix (2X, High ROX)也可以用于不需要ROX或需要低濃度ROX的熒光定量PCR儀。常用儀器所需ROX類型請參考如下表格。

本產(chǎn)品如果用于常規(guī)的96孔板qPCR檢測(建議反應(yīng)體系為20μl)，每毫升本產(chǎn)品可以進行100次檢測；如果用于常規(guī)的384孔板qPCR檢測(建議反應(yīng)體系為10μl)，每毫升本產(chǎn)品可以進行200次檢測。
包裝清單：

保存條件：
-20℃避光保存，一年有效； 4℃避光保存，一個月內(nèi)有效。盡量避免反復(fù)凍融。
注意事項：
使用前需確保整管試劑完全融化，上下顛倒輕輕混勻后使用。混勻過程中盡量避免產(chǎn)生氣泡。
注意引物退火溫度，當(dāng)退火溫度<60℃時，推薦使用三步法PCR擴增。
本產(chǎn)品中含有SYBR Green I熒光染料，保存本產(chǎn)品或設(shè)置PCR反應(yīng)時應(yīng)避免強光照射，以盡量避免熒光淬滅問題。
對于超過350bp或者高GC含量的擴增片段，建議增加延伸時間至60秒或者采用三步法以提高擴增效率。
經(jīng)測試，本產(chǎn)品反復(fù)凍融10次對使用效果無顯著影響。但仍需盡量避免反復(fù)凍融本產(chǎn)品，反復(fù)凍融可能使產(chǎn)品性能下降。

使用說明：
1. PCR反應(yīng)體系的設(shè)置： 
a. 融解并混勻PCR反應(yīng)所需的各種溶液。BeyoFast™ SYBR Green qPCR Mix (2X, High ROX)完全融解并混勻后置于冰浴上或冰盒內(nèi)。
b. 參考下表在室溫或冰浴上設(shè)置PCR反應(yīng)體系(以96孔板為例)：

注意：(1) 通常引物的終濃度為0.2-0.5μM時可獲得良好的檢測效果，也可以根據(jù)情況在0.1-1.0μM范圍內(nèi)調(diào)整引物的終濃度。
(2) 通常DNA模板的量以1-10ng cDNA或10-100ng基因組DNA為參考用量。因不同物種的模板中含有的目的基因拷貝數(shù)不同，
如有必要，可對模板進行梯度稀釋，以確定的模板使用量。RT-PCR反應(yīng)得到的cDNA直接作為模板時，其添加量不要超過PCR反應(yīng)總體積的10%。
(3) 96孔板的推薦反應(yīng)體系為20μl，也可以根據(jù)實際實驗需求，按比例擴大或縮小反應(yīng)體系。
(4) 建議設(shè)置不加模板的陰性對照組。
c. 用移液器輕輕吹打混勻或輕微Vortex混勻，室溫離心數(shù)秒，使液體積聚于管底。
d. 將設(shè)置好的PCR反應(yīng)管或PCR反應(yīng)板置于熒光定量PCR儀上，開始PCR反應(yīng)。
2. PCR反應(yīng)程序：
在Real-time PCR反應(yīng)前進行模板的預(yù)變性，通常設(shè)定為95℃ 2分鐘，復(fù)雜或高GC模板適當(dāng)延長時間至5分鐘。本產(chǎn)品中的BeyoFast™ Taq DNA Polymerase可以在15秒內(nèi)可完成至少300bp的擴增，可以滿足絕大多數(shù)的qPCR實驗；對于超過350bp或者高GC含量的擴增子，建議增加延伸時間至60秒或者采用三步法以提高擴增效率。建議采用如下的PCR程序，本程序是以ABI 7900HT熒光定量PCR儀為例：
a. 預(yù)變性：95℃ 2min
b. 變性：95℃ 15sec
c. 退火/延伸：60℃ 15-30sec
d. 重復(fù)步驟b和步驟c，總共40個循環(huán)
e. 熔解曲線分析(可選)：95℃ 15sec, 60℃ 15sec, 95℃ 15sec
f. 使用熒光定量PCR儀提供的軟件分析結(jié)果
三步法只需在退火/延伸后加一步72℃ 30sec，隨后重復(fù)步驟b、c及增加的這一步驟共40個循環(huán)即可。
注：以上舉例為常規(guī)qPCR反應(yīng)系統(tǒng)，僅供參考。實際反應(yīng)條件因模板、引物等的結(jié)構(gòu)不同而各異，需根據(jù)模板、引物、目的片段的特點設(shè)定反應(yīng)條件，并根據(jù)比例放大或縮小反應(yīng)體系。

常見問題：
1. 熒光定量PCR結(jié)果不理想，出現(xiàn)特異性不好或擴增效率不高時，可能是由于以下原因造成：
a. 引物設(shè)計不佳。請選擇適當(dāng)?shù)囊镌O(shè)計軟件進行引物設(shè)計，注意引物的GC含量、二級結(jié)構(gòu)、二聚體、退火溫度、長度、特異性等方面的問題。也可以嘗試使用有文獻報道使用過的引物，或者從信裕生物訂購經(jīng)過測試的qPCR引物。
b. 待擴增片段GC含量偏高。GC含量較高的情況下PCR會變得相對比較困難，此時宜更換引物。
c. PCR反應(yīng)體系在室溫設(shè)置時容易導(dǎo)致非特異性條帶，但在使用熱啟動酶時可以有效避免室溫操作導(dǎo)致的非特異性條帶的產(chǎn)生。
但對于一些較難擴增的產(chǎn)物，可以嘗試在冰浴上設(shè)置PCR反應(yīng)體系，以進一步減少非特異性的DNA擴增。
d. 退火溫度不佳，需要優(yōu)化。這種情況下宜更換引物。
e. 待擴增片段GC含量較高或長度較長，變性不夠充分。此時宜更換引物，使待擴增片段的GC含量和長度適中。
f. 模板量太低，此時宜適當(dāng)加大模板量。
g. 模板中含有抑制PCR反應(yīng)的物質(zhì)，可以用適當(dāng)?shù)腄NA純化方法例如柱純化等純化模板DNA。
2. 反應(yīng)條件優(yōu)化方法：
a. 引物濃度：通常引物終濃度為0.2-0.5μM時可獲得良好檢測效果，終濃度可以在0.1-1.0μM范圍內(nèi)適當(dāng)調(diào)整。如果希望提高反
應(yīng)特異性，可降低引物濃度；如果希望提高擴增效率，可增加引物的濃度，從而優(yōu)化反應(yīng)體系。
b. 退火溫度：建議采用兩步法PCR，退火溫度60℃進行反應(yīng)。如果希望提高反應(yīng)特異性，可提高退火溫度，以60-64℃作為退
火溫度的調(diào)整范圍。在引物Tm值較低而得不到良好的實驗結(jié)果時，可嘗試進行三步法PCR擴增，三步法的退火溫度請以56-64℃作為溫度設(shè)置的參考范圍。
c. 延伸時間：建議采用兩步法PCR，延伸15-30秒。對于超過350bp或者高GC含量的擴增子，建議增加延伸時間至60秒或者采用
三步法以提高擴增效率。

qPCR檢測是超高靈敏度的檢測，PCR反應(yīng)設(shè)置區(qū)域需盡量避免各種可能的待擴增產(chǎn)物的污染。PCR產(chǎn)物宜密封后丟棄，以避免超高濃度的PCR產(chǎn)物污染實驗環(huán)境。
本產(chǎn)品僅限于專業(yè)人員的科學(xué)研究用，不得用于臨床診斷或治療，不得用于食品或藥品，不得存放于普通住宅內(nèi)。
為了您的安全和健康，請穿實驗服并戴一次性手套操作。