鼠尾基因型快速鑒定試劑盒
信裕生物生產(chǎn)的鼠尾基因型快速鑒定試劑盒，也稱小鼠基因型快速鑒定試劑盒(鼠尾)(Quick Genotyping Assay Kit for Mouse Tail)可以從鼠尾、鼠耳(mouse ear)或其它組織快速提取和PCR擴(kuò)增基因組DNA，以用于小鼠基因型鑒定(genotyping)等。試劑盒提供了Easy-Load™ PCR Master Mix (Green, 2X)，PCR更便捷，PCR結(jié)束后可以直接上樣電泳。
本試劑盒能快速消化鼠尾組織樣品獲得基因組DNA，無需機(jī)械破碎、有機(jī)萃取、柱純化和DNA沉淀，鼠尾基因組DNA抽提的過程僅需約20分鐘。
本試劑盒適用于小鼠等的基因型鑒定(genotyping)，提供了小鼠基因型鑒定的對(duì)照引物，產(chǎn)物大小為299bp。
本試劑盒中提供的Easy-Load™ PCR Master Mix (Green, 2X)中含有2X Taq DNA Polymerase，2X PCR Buffer，2X dNTP和2X上樣緩沖液，只需加入適量引物、模板和水即可進(jìn)行PCR擴(kuò)增，大大簡(jiǎn)化了PCR操作，減少了PCR操作過程中可能導(dǎo)致的污染。PCR完成后可以直接上樣電泳，無需再添加上樣緩沖液。
使用本試劑盒進(jìn)行PCR檢測(cè)時(shí)僅需極少量的樣品就能完成目的基因的擴(kuò)增和分析。
使用本試劑盒提取的小鼠尾巴基因組DNA直接PCR的效果可參照?qǐng)D1。
圖1. 本試劑盒提取的小鼠尾巴基因組DNA直接PCR后的電泳圖。PCR反應(yīng)使用的引物是根據(jù)小鼠GAPDH和HSP70基因序列進(jìn)行設(shè)計(jì)的，泳道1(GAPDH)和2(HSP70)的PCR產(chǎn)物大小分別為299bp和403bp。M, marker。
對(duì)于20微升的PCR反應(yīng)體系，本試劑盒的兩種包裝分別可用于100個(gè)或500個(gè)鼠尾樣品的基因型鑒定。
包裝清單：
產(chǎn)品編號(hào)
產(chǎn)品名稱
包裝
XY-7283S-1
DNA Extraction Solution
9.6ml
XY-7283S-2
Enzyme Mix
0.4ml
XY-7283S-3
Stop Solution
10ml
XY-7283S-4
Easy-Load™ PCR Master Mix (Green, 2X)
1ml
XY-7283S-5
Control Primers for Mouse GAPDH (10μM each)
20μl
保存條件：
-20℃保存，一年有效。DNA Extraction Solution和Stop Solution可以4℃保存，3個(gè)月內(nèi)有效。
注意事項(xiàng)：
使用本試劑盒消化小鼠尾巴或其它組織樣品時(shí)，一定要確保組織樣品充分浸沒在消化液中。
配制消化液時(shí)，DNA Extraction Solution和Enzyme Mix混勻后，應(yīng)盡快使用，放置太久可能會(huì)影響DNA抽提效果。
由于PCR反應(yīng)非常靈敏，可以擴(kuò)增目的基因片段超過1000萬倍，在使用Taq酶時(shí)請(qǐng)注意避免微量待擴(kuò)增DNA的污染，并盡量考慮設(shè)置不加模板的空白對(duì)照以確認(rèn)是否有待擴(kuò)增DNA的污染。
本試劑盒中的Easy-Load™ PCR Master Mix (Green, 2X)經(jīng)過15次反復(fù)凍融后仍具有和凍融前幾乎相同的PCR擴(kuò)增效果，但仍宜適當(dāng)避免過多的反復(fù)凍融，并且在使用前，一定要完全融化，并上下顛倒輕輕混勻后才能使用，并盡量避免起泡。
本產(chǎn)品僅限于專業(yè)人員的科學(xué)研究用，不得用于臨床診斷或治療，不得用于食品或藥品，不得存放于普通住宅內(nèi)。
為了您的安全和健康，請(qǐng)穿實(shí)驗(yàn)服并戴一次性手套操作。
使用說明：
1. 小鼠尾巴、動(dòng)物組織、頭發(fā)或唾液基因組DNA的提取
a. 消化液的配制：按照樣本數(shù)量配制消化液，具體配制方法如下：
DNA Extraction Solution
96μl
960μl
注：消化液需現(xiàn)配現(xiàn)用，并需要在充分混勻后使用。
b. 不同組織樣品基因組DNA的提取。
(a) 新鮮或凍存的小鼠尾巴：實(shí)驗(yàn)前用70%的乙醇沖洗剪刀和鑷子。剪取0.2-1cm的小鼠尾尖置于上述配制好的100μl消化液中，需確保小鼠尾巴完全浸沒在溶液中(一般情況下，重量約為15mg的1cm長(zhǎng)的小鼠尾尖剛好能浸沒在含有100μl消化液的PCR管中，小鼠尾巴的重量不宜超過15mg)。對(duì)于新鮮的小鼠尾巴，建議盡量在剪下鼠尾后30分鐘內(nèi)進(jìn)行基因組DNA抽提，否則宜盡快冷凍存放。
(b) 頭發(fā)：實(shí)驗(yàn)前用70%的乙醇沖洗剪刀和鑷子。剪除頭發(fā)的多余部分，僅需保留頭發(fā)的根部區(qū)域并將其置于上述配制好的100μl消化液中，每次提取只需一根帶根部的頭發(fā)。
(c) 唾液：吸取10μl的唾液加入上述配制好的100μl消化液中，渦旋或移液槍吹打混勻。
c. 將樣品置于55℃水浴或PCR儀，孵育15分鐘。
d. 將樣品置于95℃水浴或PCR儀，孵育5分鐘(孵育結(jié)束后組織未完全消化屬于正常現(xiàn)象，不會(huì)影響試劑盒的檢測(cè)效果)。
e. 向上述樣品中加入100μl的Stop Solution，渦旋混勻。
f. 將上述提取樣品置于-20℃或4℃保存或立即進(jìn)行PCR檢測(cè)(若需長(zhǎng)期保存樣品，應(yīng)將未消化的組織去除或?qū)⑻崛∥镛D(zhuǎn)移到新的離心管中。大部分情況下，提取物4℃能保存至少1個(gè)月，-20℃至少能保存一年)。
2. PCR擴(kuò)增
a. PCR反應(yīng)體系的設(shè)置：
(a) 融解并混勻PCR反應(yīng)所需的各種溶液。將Easy-Load™ PCR Master Mix (Green, 2X)置于冰浴上或冰盒內(nèi)。
(b) 參考下表在冰浴上配制PCR反應(yīng)體系：
模板(消化產(chǎn)物)
2-20ng/μl
1μl
引物混合物(10μM each)
0.8μM
1.6μl
Easy-Load™ PCR Master Mix (Green, 2X)
1X
10μl
(c) 用移液器輕輕吹打混勻或輕微Vortex混勻，室溫離心數(shù)秒，使液體積聚于管底。
(d) 如果所使用的PCR儀有熱蓋則省略本步驟。如果PCR儀沒有熱蓋，則在管內(nèi)滴入一滴礦物油(mineral oil，ST275)。
(e) 把配制好的PCR反應(yīng)體系置于PCR儀上，開始PCR反應(yīng)。
b. PCR反應(yīng)參數(shù)的設(shè)置可以參考如下示例：
Step
Temperature
Time
Cycles
3. 瓊脂糖凝膠電泳
PCR反應(yīng)結(jié)束后直接上樣進(jìn)行瓊脂糖凝膠電泳。
常見問題：
1. PCR產(chǎn)物少或沒有目的條帶。
a. 組織提取物中的污染物抑制了PCR反應(yīng)。為檢測(cè)抑制物，可用等體積混合的DNA Extraction Solution和Stop Solution，同時(shí)用DNA對(duì)照或已知數(shù)量的模板(100-500 copies)進(jìn)行PCR反應(yīng)。
b. 組織消化不夠充分。可適當(dāng)延長(zhǎng)55℃消化時(shí)間或適當(dāng)增加Enzyme Mix的使用量。
c. Enzyme Mix未被完全滅活。適當(dāng)延長(zhǎng)消化產(chǎn)物在95℃的孵育時(shí)間。
d. 引物設(shè)計(jì)不佳是PCR過程中最常見的問題。請(qǐng)選擇適當(dāng)?shù)囊镌O(shè)計(jì)軟件進(jìn)行引物設(shè)計(jì)，注意引物的GC含量、二級(jí)結(jié)構(gòu)、二聚體、退火溫度、長(zhǎng)度、特異性等方面的問題。在加入酶切位點(diǎn)等的引物中，一定要注意加入酶切位點(diǎn)等后整條引物的GC含量、二級(jí)結(jié)構(gòu)、二聚體、退火溫度、長(zhǎng)度、特異性等方面的問題。在原有引物效果不佳的情況并且陽性對(duì)照引物可以正常工作的情況下，可以考慮更換引物。
e. 待擴(kuò)增片段GC含量偏高。GC含量較高的情況下PCR會(huì)變得相對(duì)比較困難，此時(shí)可以使用適合擴(kuò)增高GC含量DNA片段的GC-rich buffer，并相應(yīng)地根據(jù)GC-rich buffer的要求或說明調(diào)整PCR反應(yīng)參數(shù)的設(shè)置。
f. 長(zhǎng)片段擴(kuò)增。盡管Taq DNA polymerase可以擴(kuò)增最長(zhǎng)達(dá)8kb的DNA片段，但大多數(shù)時(shí)候比較適合擴(kuò)增2-3kb以下的片段，更長(zhǎng)片段的擴(kuò)增推薦使用其它更適合長(zhǎng)片段擴(kuò)增的DNA聚合酶。
g. PCR反應(yīng)設(shè)置時(shí)在室溫進(jìn)行容易導(dǎo)致非特異性條件。推薦在冰浴上設(shè)置PCR反應(yīng)。
h. 由于引物存在一定的二級(jí)結(jié)構(gòu)或存在一定的引物二聚體，或引物偏短，導(dǎo)致退火效果不佳。此時(shí)可以采用Touch down等方法進(jìn)行退火，通常采用從65℃逐步緩慢降溫到55℃或50℃的方法，使退火更加充分。
i. 退火溫度不佳，需要優(yōu)化。如果有溫度梯度PCR儀，則可以設(shè)置退火的溫度梯度，摸索退火的溫度。如果沒有溫度梯度PCR儀，則可以通過多次PCR反應(yīng)摸索的退火溫度。
j. 延伸時(shí)間不足?？砂凑彰?kb片段延伸1分鐘進(jìn)行設(shè)置，對(duì)于較難擴(kuò)增的片段可以設(shè)置為每1kb片段延伸1.5-2分鐘。
k. 待擴(kuò)增片段GC含量較高或長(zhǎng)度較長(zhǎng)，變性不夠充分?？梢哉{(diào)節(jié)起始變性條件至95℃ 1min甚至95℃ 2-4min。
l. 在不同PCR儀上進(jìn)行PCR反應(yīng)，避免有時(shí)PCR儀出現(xiàn)問題。
m. 循環(huán)數(shù)不足，適當(dāng)延長(zhǎng)PCR的循環(huán)數(shù)。通常循環(huán)數(shù)最高不必超過40，常用的循環(huán)數(shù)范圍為25-35。
n. 模板含量太低，適當(dāng)加大模板量，或采用巢式PCR(nested PCR)或二次PCR。巢式PCR即為在原先設(shè)計(jì)的PCR引物內(nèi)側(cè)再設(shè)計(jì)一對(duì)PCR引物，然后對(duì)次PCR產(chǎn)物進(jìn)行稀釋后再進(jìn)行一次PCR擴(kuò)增，這樣一方面可以起到擴(kuò)增作用，同時(shí)也可以從次PCR產(chǎn)物中擴(kuò)增出特異性條帶。二次PCR則為比較簡(jiǎn)單地用原有引物對(duì)次PCR產(chǎn)物進(jìn)行稀釋后再進(jìn)行一次PCR擴(kuò)增，可以起到擴(kuò)增作用，但不能去除非特異性條帶。
o. 注意設(shè)置適當(dāng)?shù)年栃詫?duì)照和陰性對(duì)照通常會(huì)有很大幫助。
2. 組織在孵育后未完全消化。
a. 有些組織很難完全消化。信裕生物生產(chǎn)的直接PCR試劑盒不要求組織完全消化，部分消化提取的DNA通常也足夠滿足PCR檢測(cè)。
關(guān)鍵字： 鼠尾基因型快速鑒定試劑盒說明書；鼠尾基因型快速鑒定試劑盒廠家
上海康朗生物科技有限公司是一家集研發(fā)、生產(chǎn)、銷售、服務(wù)于一體的一家生物科技企業(yè)，專營(yíng)生化試劑、標(biāo)準(zhǔn)品、基因、蛋白、抗體、Elisa試劑盒、細(xì)胞生物學(xué)，分子生物學(xué)等高生物產(chǎn)品?？偛课挥谏虾?，并在北京、廣東，江西，吉林等全國(guó)30多個(gè)省市設(shè)有分公司和代理機(jī)構(gòu)。涉及的產(chǎn)品被中國(guó)科學(xué)院、清華、北大、復(fù)旦，上海交大，復(fù)旦醫(yī)學(xué)院，上海中醫(yī)藥大學(xué)，華東師范大學(xué)，第二軍醫(yī)大學(xué)，曙光醫(yī)院，浦東新區(qū)人民醫(yī)院等知名科研院所廣泛使用，可靠而穩(wěn)定的質(zhì)量和完善的售后服務(wù)確。