鼠尾基因型快速鑒定試劑盒

信裕生物生產(chǎn)的鼠尾基因型快速鑒定試劑盒，也稱小鼠基因型快速鑒定試劑盒(鼠尾)(Quick Genotyping Assay Kit for Mouse Tail)可以從鼠尾、鼠耳(mouse ear)或其它組織快速提取和PCR擴(kuò)增基因組DNA，以用于小鼠基因型鑒定(genotyping)等。試劑盒提供了Easy-Load™ PCR Master Mix (Green, 2X)，PCR更便捷，PCR結(jié)束后可以直接上樣電泳。
本試劑盒能快速消化鼠尾組織樣品獲得基因組DNA，無需機(jī)械破碎、有機(jī)萃取、柱純化和DNA沉淀，鼠尾基因組DNA抽提的過程僅需約20分鐘。
本試劑盒適用于小鼠等的基因型鑒定(genotyping)，提供了小鼠基因型鑒定的對照引物，產(chǎn)物大小為299bp。
本試劑盒中提供的Easy-Load™ PCR Master Mix (Green, 2X)中含有2X Taq DNA Polymerase，2X PCR Buffer，2X dNTP和2X上樣緩沖液，只需加入適量引物、模板和水即可進(jìn)行PCR擴(kuò)增，大大簡化了PCR操作，減少了PCR操作過程中可能導(dǎo)致的污染。PCR完成后可以直接上樣電泳，無需再添加上樣緩沖液。
使用本試劑盒進(jìn)行PCR檢測時僅需極少量的樣品就能完成目的基因的擴(kuò)增和分析。
使用本試劑盒提取的小鼠尾巴基因組DNA直接PCR的效果可參照圖1。

圖1. 本試劑盒提取的小鼠尾巴基因組DNA直接PCR后的電泳圖。PCR反應(yīng)使用的引物是根據(jù)小鼠GAPDH和HSP70基因序列進(jìn)行設(shè)計(jì)的，泳道1(GAPDH)和2(HSP70)的PCR產(chǎn)物大小分別為299bp和403bp。M, marker。

對于20微升的PCR反應(yīng)體系，本試劑盒的兩種包裝分別可用于100個或500個鼠尾樣品的基因型鑒定。
包裝清單：

保存條件：
-20℃保存，一年有效。DNA Extraction Solution和Stop Solution可以4℃保存，3個月內(nèi)有效。
注意事項(xiàng)：
使用本試劑盒消化小鼠尾巴或其它組織樣品時，一定要確保組織樣品充分浸沒在消化液中。
配制消化液時，DNA Extraction Solution和Enzyme Mix混勻后，應(yīng)盡快使用，放置太久可能會影響DNA抽提效果。
由于PCR反應(yīng)非常靈敏，可以擴(kuò)增目的基因片段超過1000萬倍，在使用Taq酶時請注意避免微量待擴(kuò)增DNA的污染，并盡量考慮設(shè)置不加模板的空白對照以確認(rèn)是否有待擴(kuò)增DNA的污染。
本試劑盒中的Easy-Load™ PCR Master Mix (Green, 2X)經(jīng)過15次反復(fù)凍融后仍具有和凍融前幾乎相同的PCR擴(kuò)增效果，但仍宜適當(dāng)避免過多的反復(fù)凍融，并且在使用前，一定要完全融化，并上下顛倒輕輕混勻后才能使用，并盡量避免起泡。
本產(chǎn)品僅限于專業(yè)人員的科學(xué)研究用，不得用于臨床診斷或治療，不得用于食品或藥品，不得存放于普通住宅內(nèi)。
為了您的安全和健康，請穿實(shí)驗(yàn)服并戴一次性手套操作。
 

使用說明： 
1. 小鼠尾巴、動物組織、頭發(fā)或唾液基因組DNA的提取
a. 消化液的配制：按照樣本數(shù)量配制消化液，具體配制方法如下：

      注：消化液需現(xiàn)配現(xiàn)用，并需要在充分混勻后使用。
b. 不同組織樣品基因組DNA的提取。
(a) 新鮮或凍存的小鼠尾巴：實(shí)驗(yàn)前用70%的乙醇沖洗剪刀和鑷子。剪取0.2-1cm的小鼠尾尖置于上述配制好的100μl消化液中，需確保小鼠尾巴完全浸沒在溶液中(一般情況下，重量約為15mg的1cm長的小鼠尾尖剛好能浸沒在含有100μl消化液的PCR管中，小鼠尾巴的重量不宜超過15mg)。對于新鮮的小鼠尾巴，建議盡量在剪下鼠尾后30分鐘內(nèi)進(jìn)行基因組DNA抽提，否則宜盡快冷凍存放。
(b) 頭發(fā)：實(shí)驗(yàn)前用70%的乙醇沖洗剪刀和鑷子。剪除頭發(fā)的多余部分，僅需保留頭發(fā)的根部區(qū)域并將其置于上述配制好的100μl消化液中，每次提取只需一根帶根部的頭發(fā)。
(c) 唾液：吸取10μl的唾液加入上述配制好的100μl消化液中，渦旋或移液槍吹打混勻。
c. 將樣品置于55℃水浴或PCR儀，孵育15分鐘。
d. 將樣品置于95℃水浴或PCR儀，孵育5分鐘(孵育結(jié)束后組織未完全消化屬于正常現(xiàn)象，不會影響試劑盒的檢測效果)。
e. 向上述樣品中加入100μl的Stop Solution，渦旋混勻。
f. 將上述提取樣品置于-20℃或4℃保存或立即進(jìn)行PCR檢測(若需長期保存樣品，應(yīng)將未消化的組織去除或?qū)⑻崛∥镛D(zhuǎn)移到新的離心管中。大部分情況下，提取物4℃能保存至少1個月，-20℃至少能保存一年)。
2. PCR擴(kuò)增
a. PCR反應(yīng)體系的設(shè)置：
(a) 融解并混勻PCR反應(yīng)所需的各種溶液。將Easy-Load™ PCR Master Mix (Green, 2X)置于冰浴上或冰盒內(nèi)。
(b) 參考下表在冰浴上配制PCR反應(yīng)體系：

(c) 用移液器輕輕吹打混勻或輕微Vortex混勻，室溫離心數(shù)秒，使液體積聚于管底。
(d) 如果所使用的PCR儀有熱蓋則省略本步驟。如果PCR儀沒有熱蓋，則在管內(nèi)滴入一滴礦物油(mineral oil，ST275)。
(e) 把配制好的PCR反應(yīng)體系置于PCR儀上，開始PCR反應(yīng)。
b. PCR反應(yīng)參數(shù)的設(shè)置可以參考如下示例：

3. 瓊脂糖凝膠電泳
PCR反應(yīng)結(jié)束后直接上樣進(jìn)行瓊脂糖凝膠電泳。

常見問題：
1. PCR產(chǎn)物少或沒有目的條帶。
a. 組織提取物中的污染物抑制了PCR反應(yīng)。為檢測抑制物，可用等體積混合的DNA Extraction Solution和Stop Solution，同時用DNA對照或已知數(shù)量的模板(100-500 copies)進(jìn)行PCR反應(yīng)。
b. 組織消化不夠充分。可適當(dāng)延長55℃消化時間或適當(dāng)增加Enzyme Mix的使用量。
c. Enzyme Mix未被完全滅活。適當(dāng)延長消化產(chǎn)物在95℃的孵育時間。
d. 引物設(shè)計(jì)不佳是PCR過程中最常見的問題。請選擇適當(dāng)?shù)囊镌O(shè)計(jì)軟件進(jìn)行引物設(shè)計(jì)，注意引物的GC含量、二級結(jié)構(gòu)、二聚體、退火溫度、長度、特異性等方面的問題。在加入酶切位點(diǎn)等的引物中，一定要注意加入酶切位點(diǎn)等后整條引物的GC含量、二級結(jié)構(gòu)、二聚體、退火溫度、長度、特異性等方面的問題。在原有引物效果不佳的情況并且陽性對照引物可以正常工作的情況下，可以考慮更換引物。
e. 待擴(kuò)增片段GC含量偏高。GC含量較高的情況下PCR會變得相對比較困難，此時可以使用適合擴(kuò)增高GC含量DNA片段的GC-rich buffer，并相應(yīng)地根據(jù)GC-rich buffer的要求或說明調(diào)整PCR反應(yīng)參數(shù)的設(shè)置。
f. 長片段擴(kuò)增。盡管Taq DNA polymerase可以擴(kuò)增最長達(dá)8kb的DNA片段，但大多數(shù)時候比較適合擴(kuò)增2-3kb以下的片段，更長片段的擴(kuò)增推薦使用其它更適合長片段擴(kuò)增的DNA聚合酶。
g. PCR反應(yīng)設(shè)置時在室溫進(jìn)行容易導(dǎo)致非特異性條件。推薦在冰浴上設(shè)置PCR反應(yīng)。
h. 由于引物存在一定的二級結(jié)構(gòu)或存在一定的引物二聚體，或引物偏短，導(dǎo)致退火效果不佳。此時可以采用Touch down等方法進(jìn)行退火，通常采用從65℃逐步緩慢降溫到55℃或50℃的方法，使退火更加充分。
i. 退火溫度不佳，需要優(yōu)化。如果有溫度梯度PCR儀，則可以設(shè)置退火的溫度梯度，摸索退火的溫度。如果沒有溫度梯度PCR儀，則可以通過多次PCR反應(yīng)摸索的退火溫度。
j. 延伸時間不足?？砂凑彰?kb片段延伸1分鐘進(jìn)行設(shè)置，對于較難擴(kuò)增的片段可以設(shè)置為每1kb片段延伸1.5-2分鐘。
k. 待擴(kuò)增片段GC含量較高或長度較長，變性不夠充分。可以調(diào)節(jié)起始變性條件至95℃ 1min甚至95℃ 2-4min。
l. 在不同PCR儀上進(jìn)行PCR反應(yīng)，避免有時PCR儀出現(xiàn)問題。
m. 循環(huán)數(shù)不足，適當(dāng)延長PCR的循環(huán)數(shù)。通常循環(huán)數(shù)最高不必超過40，常用的循環(huán)數(shù)范圍為25-35。
n. 模板含量太低，適當(dāng)加大模板量，或采用巢式PCR(nested PCR)或二次PCR。巢式PCR即為在原先設(shè)計(jì)的PCR引物內(nèi)側(cè)再設(shè)計(jì)一對PCR引物，然后對次PCR產(chǎn)物進(jìn)行稀釋后再進(jìn)行一次PCR擴(kuò)增，這樣一方面可以起到擴(kuò)增作用，同時也可以從次PCR產(chǎn)物中擴(kuò)增出特異性條帶。二次PCR則為比較簡單地用原有引物對次PCR產(chǎn)物進(jìn)行稀釋后再進(jìn)行一次PCR擴(kuò)增，可以起到擴(kuò)增作用，但不能去除非特異性條帶。
o. 注意設(shè)置適當(dāng)?shù)年栃詫φ蘸完幮詫φ胀ǔ泻艽髱椭?br /> 2. 組織在孵育后未完全消化。
a. 有些組織很難完全消化。信裕生物生產(chǎn)的直接PCR試劑盒不要求組織完全消化，部分消化提取的DNA通常也足夠滿足PCR檢測。