Pfu DNA Polymerase

Pfu DNA Polymerase簡稱Pfu酶，是最常用的高保真DNA聚合酶之一。
Pfu DNA Polymerase是一種來源于嗜熱菌Pyrococcus furiosus的高度熱穩(wěn)定的DNA聚合酶。Pfu酶的分子量為90kDa。Pfu酶可以催化5’至3’方向的依賴于DNA模板的脫氧核苷酸的聚合。和Taq酶不同，Pfu酶有3’至5’的外切酶活性(proofreading activity)。另外，Pfu酶有5’至3’外切酶活性，但Pfu酶沒有反轉(zhuǎn)錄酶活性。
由于Pfu酶有3’至5’的外切酶活性，因此在PCR擴增過程中出錯的幾率大大降低，出錯率為2.6×10^-6 per nt per cycle。Pfu的出錯率不僅遠遠低于Taq酶，也低于一些其它的高保真DNA聚合酶例如Vent、DeepVent、Pwo、Tli等，因此Pfu酶常作為的高性價比的高保真DNA聚合酶。
來源：本Pfu DNA Polymerase為recombinant Pfu DNA Polymerase，通過大腸桿菌表達純化獲得，和純化獲得的天然Pfu DNA Polymerase在各方面的性質(zhì)相同。
用途：高保真PCR (high fidelity PCR)、點突變、雙平端PCR克隆等。
Pfu酶擴增出來的DNA片段為雙平端，可以用于雙平端克隆，但不能用于常規(guī)的T載體克隆。
dUTP和dITP或含有dUTP和dITP的引物不能用于Pfu酶介導(dǎo)的PCR擴增反應(yīng)。
活性定義：One unit of the enzyme catalyzes the incorporation of 10 nmol of deoxyribonucleotides into a 
polynucleotide fraction (adsorbed on DE-81) in 30 min at 72℃. Enzyme activity is assayed in the following mixture: 20 mM Tris-HCl (pH 8.8 at 25℃), 2 mM MgSO₄, 10 mM (NH₄)₂SO₄, 10 mM KCl, 0.1% (v/v) Triton X-100, 0.1 mg/ml BSA, 0.75 mM activated calf thymus DNA, 0.2 mM of each dNTP, 0.4 MBq/ml [³H]-dTTP.
純度：不含DNA內(nèi)切酶、外切酶和磷酸酯酶，不含RNA酶，滿足常規(guī)PCR反應(yīng)要求。
酶儲存溶液：20 mM Tris-HCl (pH 8.2), 1 mM DTT, 0.1 mM EDTA, 100 mM KCl, 0.1% (v/v) Nonidet P40, 0.1% (v/v)
Tween 20 and 50% (v/v) glycerol。
10X Pfu Buffer (with Mg²⁺)：200 mM Tris-HCl (pH 8.8 at 25℃), 100 mM (NH₄)₂SO₄, 20 mM MgSO₄, 100 mM
KCl,1% (v/v) Triton X-100, 1 mg/ml BSA。
失活或抑制：酚氯仿抽提可以使Pfu酶失活。 
包裝清單：

保存條件：
-20℃保存。
注意事項：
由于PCR反應(yīng)非常靈敏可以擴增目的基因序列超過1000萬倍，在使用Pfu酶時請注意避免微量待擴增DNA的污染，并盡量考慮設(shè)置不加模板的空白對照以確認是否有待擴增DNA的污染。
Pfu DNA polymerase在擴增DNA片段時的出錯率非常低，但其擴增效率也比較低。對于出錯率要求不高的情況，例如RT-PCR進行定量或半定量，推薦使用Taq DNA polymerase。在擴增效率和出錯率需要兼顧的情況，可以選擇BeyoTaq DNA polymerase。在擴增2kb以下DNA片段時，Pfu酶和Taq酶的擴增效率相近。在準確性要求很高的情況下，須選擇Pfu酶。
Pfu酶有3’至5’的外切酶活性，在沒有dNTP的情況下可以降解引物。因此Pfu酶一定要最后加入，并且要在冰浴上操作。
不能使用Taq酶的PCR Buffer來替代Pfu酶的PCR Buffer。
本產(chǎn)品僅限于專業(yè)人員的科學(xué)研究用，不得用于臨床診斷或治療，不得用于食品或藥品，不得存放于普通住宅內(nèi)。
為了您的安全和健康，請穿實驗服并戴一次性手套操作。
使用說明：

1. 1.PCR反應(yīng)體系的設(shè)置：
   1. a.溶解并混勻PCR反應(yīng)所需的各種溶液。將Pfu DNA Polymerase置于冰浴上或冰盒內(nèi)。
   2. b.參考下表在冰浴上設(shè)置PCR反應(yīng)(如果有多個類似的PCR反應(yīng)，可以先配制大體積的包含水、buffer、dNTP和Pfu酶的混合物，然后分裝到各PCR反應(yīng)管內(nèi)。根據(jù)情況，有時混合物中可以包括引物)：
      ▼

      ▲

      試劑

      最終濃度

      體積

      雙蒸水或Milli-Q水

      -

      (36.75-x)μl

      10X Pfu Buffer (with Mg²⁺)

      1X

      5μl

      dNTP (2.5mM each)

      0.2mM each

      4μl

      模板DNA

      10pg-1μg*

      xμl

      引物混合物(10μM each)

      0.8μM

      4μl

      Pfu DNA Polymerase (5U/μl)

      1.25U/50μl

      0.25μl

      總體積

      -

      50μl
      • *對于不同類型的模板在50μl反應(yīng)體積中推薦用量如下：哺乳動物基因組DNA：0.1-1μg；大腸桿菌基因組DNA：10-100ng；質(zhì)粒DNA：0.1-10ng。過多的模板DNA容易導(dǎo)致非特異性的PCR產(chǎn)物。
   3. c.用移液器輕輕吹打混勻或輕微Vortex混勻，室溫離心數(shù)秒，使液體積聚于管底。
   4. d.如果所使用的PCR儀有熱蓋則省略本步驟。如果PCR儀沒有熱蓋，則在管內(nèi)滴入一滴礦物油(mineral oil，ST275)。
   5. e.各設(shè)置好的PCR反應(yīng)管置于PCR儀上，開始PCR反應(yīng)。
2. 2.PCR反應(yīng)參數(shù)的設(shè)置可以參考如下示例：
   • STEP1(起始變性): 94℃ 3min
   • STEP2(變性): 94℃ 30sec
   • STEP3(退火): 55℃ 30sec
   • STEP4(延伸): 72℃ 2min
   • STEP5(循環(huán)): Go To STEP2 for 30 cycles
   • STEP6(最終延伸): 72℃ 10min
   • STEP7(臨時保存): 4℃ forever
   1. a.PCR反應(yīng)的設(shè)置需根據(jù)模板、引物、PCR產(chǎn)物的長度和GC含量等條件的不同設(shè)定不同的PCR反應(yīng)條件包括溫度、時間和循環(huán)數(shù)等。
   2. b.STEP4(延伸)的時間設(shè)置需根據(jù)PCR產(chǎn)物的長度進行設(shè)置，通常每kb產(chǎn)物的延伸時間為2分鐘。例如PCR產(chǎn)物的長度為1kb，則延伸時間可以設(shè)置為2分鐘，PCR產(chǎn)物的長度為2kb，則延伸時間可以設(shè)置為4分鐘，以此類推。
   3. c.對于初次進行的PCR，為盡量確?？梢詳U增出預(yù)期的PCR產(chǎn)物，可以把循環(huán)數(shù)設(shè)置為35。對于需進行半定量或定量的PCR反應(yīng)循環(huán)數(shù)一定要進行適當(dāng)優(yōu)化，使PCR反應(yīng)沒有達到平臺期。

常見問題：

1. 1.PCR產(chǎn)物非常少或沒有特異性條帶。
   1. a.引物設(shè)計不佳是PCR過程中最常見的問題。請選擇適當(dāng)?shù)囊镌O(shè)計軟件進行引物設(shè)計，注意引物的GC含量、二級結(jié)構(gòu)、二聚體、退火溫度、長度、特異性等方面的問題。在加入酶切位點等的引物中，一定要注意加入酶切位點等后整條引物的GC含量、二級結(jié)構(gòu)、二聚體、退火溫度、長度、特異性等方面的問題。在原有引物效果不佳的情況并且陽性對照引物可以正常工作的情況下，可以考慮更換引物。
   2. b.待擴增片段GC含量偏高。GC含量較高的情況下PCR會變得相對比較困難，此時可以使用適合擴增高GC含量DNA片段的GC-rich buffer，并相應(yīng)地根據(jù)GC-rich buffer的要求或說明調(diào)整PCR反應(yīng)參數(shù)的設(shè)置。
   3. c.長片段擴增。盡管Pfu DNA polymerase可以擴增較長的DNA片段，但大多數(shù)時候比較適合擴增5kb以下的片段，更長片段的擴增推薦使用其它更適合長片段擴增的DNA聚合酶。
   4. d.PCR反應(yīng)設(shè)置時在室溫進行容易導(dǎo)致非特異性條件。推薦在冰浴上設(shè)置PCR反應(yīng)。
   5. e.由于引物存在一定的二級結(jié)構(gòu)或存在一定的引物二聚體，或引物偏短，導(dǎo)致退火效果不佳。此時可以采用Touch down等方法進行退火，通常采用從65℃逐步緩慢降溫到55℃或50℃的方法，使退火更加充分。
   6. f.退火溫度不佳，需要優(yōu)化。如果有溫度梯度PCR儀，則可以設(shè)置退火的溫度梯度，摸索退火的溫度。如果沒有溫度梯度PCR儀，則可以通過多次PCR反應(yīng)摸索的退火溫度。
   7. g.延伸時間不足。可按照每1kb片段延伸3分鐘進行設(shè)置，對于較難擴增的片段可以設(shè)置為每1kb片段延伸5分鐘。
   8. h.待擴增片段GC含量較高或長度較長，變性不夠充分?？梢哉{(diào)節(jié)起始變性條件至95℃ 1min甚至95℃ 2-4min。
   9. i.在不同PCR儀上進行PCR反應(yīng)，避免有時PCR儀出現(xiàn)問題。
   10. j.循環(huán)數(shù)不足，適當(dāng)延長PCR的循環(huán)數(shù)。通常循環(huán)數(shù)最高不必超過40，常用的循環(huán)數(shù)范圍為25-35。
   11. k.模板含量太低，適當(dāng)加大模板量，或采用巢式PCR(nested PCR)或二次PCR。巢式PCR即為在原先設(shè)計的PCR引物內(nèi)側(cè)再設(shè)計一對PCR引物，然后對次PCR產(chǎn)物進行稀釋后再進行一次PCR擴增，這樣一方面可以起到擴增作用，同時也可以從次PCR產(chǎn)物中擴增出特異性條帶。二次PCR則為比較簡單地用原有引物對次PCR產(chǎn)物進行稀釋后再進行一次PCR擴增，可以起到擴增作用，但不能去除非特異性條帶。
   12. l.模板中含有抑制PCR反應(yīng)的物質(zhì)，可以用適當(dāng)?shù)腄NA純化方法例如柱純化等純化模板DNA。
   13. m.當(dāng)產(chǎn)生較多非特異性條帶時，可以適當(dāng)提高退火溫度。
   14. n.擴增效率偏低。選擇可以兼顧擴增效率和準確率的DNA polymerase，例如BeyoTaq DNA polymerase等。
   15. o.注意設(shè)置適當(dāng)?shù)年栃詫φ蘸完幮詫φ胀ǔ泻艽髱椭?/li>