QuickMutation™基因定點(diǎn)突變試劑盒

信裕生物生產(chǎn)的QuickMutation™基因定點(diǎn)突變試劑盒(QuickMutation™ Site-Directed Mutagenesis Kit)可以快速完成質(zhì)粒DNA的點(diǎn)突變(point mutation)，多個鄰近密碼子的突變，單個或多個鄰近密碼子的缺失(deletion)或插入(insertion)突變。
基因定點(diǎn)突變常用于研究基因的轉(zhuǎn)錄調(diào)控、RNA或蛋白質(zhì)的結(jié)構(gòu)和功能，以及用于質(zhì)粒中部分序列的微調(diào)等。
本試劑盒利用了目前最常用的基因點(diǎn)突變技術(shù)，只需通過基于PCR的突變質(zhì)粒的生成，和基于DpnI的模板質(zhì)粒的消化，轉(zhuǎn)化培養(yǎng)以及后續(xù)的酶切或測序鑒定，即可得到預(yù)期的突變質(zhì)粒 (參考圖1)。DpnI消化僅需5分鐘，累計操作時間不足2小時即可完成
基因的定點(diǎn)突變。

圖1.基因定點(diǎn)突變試劑盒原理圖

本試劑盒使用了最新的保真性更強(qiáng)，靈敏度更高，擴(kuò)增速度可達(dá)2kb/min，擴(kuò)增長度可達(dá)12kb的BeyoFusion™ DNA Polymerase，從而大大縮短了突變反應(yīng)所需的時間，進(jìn)一步提高了基因定點(diǎn)突變的成功率。同時進(jìn)一步嚴(yán)格驗(yàn)證了試劑盒中的DpnI，確保能在5分鐘內(nèi)充分消化掉甲基化的模板質(zhì)粒，同時不會消化未甲基化的PCR產(chǎn)物。
參考圖1，使用本試劑盒時需要先設(shè)計長度通常為25-45個堿基互補(bǔ)的兩個引物，在引物中含有預(yù)期的突變位點(diǎn)。然后以待突變的質(zhì)粒為模板，用這兩個引物進(jìn)行PCR擴(kuò)增反應(yīng)。這樣可以產(chǎn)生含有預(yù)期的突變位點(diǎn)的雙鏈質(zhì)粒，但這個雙鏈質(zhì)粒中有兩個nick位點(diǎn)。待突變的質(zhì)粒通常來源于DH5α等dam⁺大腸桿菌，在這些dam⁺細(xì)菌中質(zhì)粒會被甲基化修飾，而在體外通過PCR擴(kuò)增得到的質(zhì)粒不會被甲基化。這樣用特異性識別甲基化位點(diǎn)的酶DpnI處理，可以消化掉待突變的質(zhì)粒模板，而使通過PCR擴(kuò)增出來的含有突變位點(diǎn)的質(zhì)粒被選擇性地保留下來。隨后把DpnI處理過的產(chǎn)物轉(zhuǎn)化感受態(tài)細(xì)菌后，突變質(zhì)粒中的兩個nick位點(diǎn)可以被大腸桿菌修復(fù)，得到的克隆就會含有預(yù)期的突變質(zhì)粒了。
本試劑盒提供了DH5α甘油菌，可用于感受態(tài)細(xì)菌的制備。
本試劑盒分別使用6kb和12kb的質(zhì)粒進(jìn)行了點(diǎn)突變測試，實(shí)測突變率接近100%(參考圖2)。實(shí)際進(jìn)行點(diǎn)突變時，可能會因?yàn)橥蛔円锏脑O(shè)計、模板使用量、感受態(tài)效率等因素出現(xiàn)不同的突變率。

圖2. 本試劑盒實(shí)際使用效果圖。A. 使用本試劑盒進(jìn)行點(diǎn)突變獲得的LB平板照片。以一個6kb質(zhì)粒為模板，使用本試劑盒進(jìn)行PCR擴(kuò)增以實(shí)現(xiàn)點(diǎn)突變，DpnI 37℃消化5min，取10μl產(chǎn)物轉(zhuǎn)化100μl DH5α感受態(tài)，涂板后37℃培養(yǎng)過夜所獲得的LB平板照片。B. 陰性對照LB平板照片。與A相比沒有添加BeyoFusion™ DNA Polymerase，這樣模板質(zhì)粒完全被DpnI酶所消化，沒有任何的假陽性克隆產(chǎn)生。C. 突變前后的測序圖。突變前的測序結(jié)果(WT, wild type)和從圖A中挑取9個克隆的測序結(jié)果(Mu,mutant)。箭頭所示為擬突變的位點(diǎn)，紅色下劃線的為突變前和突變后的堿基。本次實(shí)驗(yàn)的突變率達(dá)到了100%。

本試劑盒共可以進(jìn)行十次基因定點(diǎn)突變反應(yīng)。
包裝清單：

保存條件：
-20℃保存，一年有效。
注意事項：
需自行配制LB液體培養(yǎng)基和LB平板以用于細(xì)菌的培養(yǎng)。
需自行設(shè)計和合成用于基因定點(diǎn)突變的引物。需自備用于細(xì)菌轉(zhuǎn)化的試劑。
使用本試劑盒前請先閱讀后面的常見問題。
本產(chǎn)品僅限于專業(yè)人員的科學(xué)研究用，不得用于臨床診斷或治療，不得用于食品或藥品，不得存放于普通住宅內(nèi)。
為了您的安全和健康，請穿實(shí)驗(yàn)服并戴一次性手套操作。
 

使用說明：
1. 引物設(shè)計：
用于特定基因突變的引物需要單獨(dú)設(shè)計，請參考如下一些基本原則進(jìn)行設(shè)計：
a. 共需設(shè)計兩條互補(bǔ)的引物?？梢韵燃性O(shè)計一條，然后就可以得到互補(bǔ)的另一條引物。
b. 引物的長度通常為25-45個堿基。
c. 利用如下公式進(jìn)行引物Tm值的估算，通常Tm值應(yīng)該不低于78℃。
Tm = 81.5 + 0.41(%GC) - (675/N) - %mismatch
N表示引物所含堿基總數(shù)
%GC表示引物中GC堿基數(shù)占引物總堿基數(shù)的百分值，例如GC含量為50%，那么%GC就是50。
%mismatch表示引物中突變堿基數(shù)占引物總堿基數(shù)的百分值，例如錯配率是2.5%，那么%mismatch就是2.5。
例一：對于模板序列5'-CCAATTTCGAGGAATTAGAACCTTATTTTGAACTTACTGAAGG-3'，其中帶有灰色陰影的A為待突變位點(diǎn)，需要突變?yōu)镃，設(shè)計正向突變引物如下:
5'-CCAATTTCGAGGAATTAGCACCTTATTTTGAACTTACTGAAGG-3' 
Tm = 81.5 + 0.41*(15/43)*100 - (675/43) - (1/43)*100 = 77.8
例二：對于模板序列5'-GGGAGCTCACCAAGCTGAAGAGCACCTACATTGA-3'，其中兩個有灰色陰影的A為待突變位點(diǎn)，均需要突變?yōu)镚，設(shè)計正向突變引物如下：
5'-GGGAGCTCACCAGGCTGAGGAGCACCTACATTGA-3' 
Tm = 81.5 + 0.41*(20/34)*100 - (675/34) - (2/34)*100 = 79.9
對于插入、缺失型的突變引物，推薦利用如下公式進(jìn)行引物Tm值的估算： 
Tm=81.5 + 0.41(％GC) ? (675/N)
此公式中，N不包含插入或缺失的堿基。因?yàn)槿绻鸑包含插入或缺失的堿基，數(shù)字可能會比較大，從而影響計算結(jié)果。
d. 也可以利用如下公式進(jìn)行引物設(shè)計。
引物中突變位點(diǎn)任何一側(cè)都必需滿足4*(GC堿基數(shù)) + 2*(AT堿基數(shù)) ≥ 45。但引物也不宜過長，否則通常會形成非常穩(wěn)定的二級結(jié)構(gòu)。通常把突變位點(diǎn)兩側(cè)的堿基數(shù)控制在15個左右，且使兩側(cè)按照上述計算得到的數(shù)值相近。
例如引物為AGTCAGGCCAATTCGAAGCAGTCGAATTGCCAAG，其中有灰色陰影的AAG為突變位點(diǎn)，則
左側(cè)：4*(GC堿基數(shù)) + 2*(AT堿基數(shù)) ＝ 4*8 + 2*7 ＝ 46 ≥ 45
右側(cè)：4*(GC堿基數(shù)) + 2*(AT堿基數(shù)) ＝ 4*8 + 2*8 ＝ 48 ≥ 45
e. 上述c和d這兩種方法的計算標(biāo)準(zhǔn)有較明顯的差異，但經(jīng)過多次測試，兩種方法都可以順利獲得預(yù)期的突變。
f. 在可能的情況下，盡量把引物的GC含量控制在40-60%。
g. 在可能的情況下，盡量使引物不要產(chǎn)生非常穩(wěn)定的二級結(jié)構(gòu)和引物二聚體。二級結(jié)構(gòu)和二聚體可通過一些軟件進(jìn)行分析。
h. 使用經(jīng)過PAGE純化的引物或更高純度的引物。
2. 引物的配制：
如果合成得到的一個引物A的量是20nmol，另外一個互補(bǔ)引物B的量是19nmol。在引物A中加入200μl水，配制成濃度為100μM，在引物B中加入190μl水也配制成濃度為100μM。吸取20μl 100μM引物A和20μl 100μM引物B到一新的離心管中，再加入160μl水，混勻后即可得到可以直接用于基因定點(diǎn)突變反應(yīng)的引物(10μM each)。
3. 待突變模板質(zhì)粒的選擇：
選擇GC含量在40-55%的待突變模板質(zhì)粒，并且每一個50bp左右的局部GC含量也不超過70%。如果GC含量過高，請先把目的基因克隆到其它合適的載體上，再進(jìn)行基因定點(diǎn)突變反應(yīng)。另外目的基因GC含量也在40-55%的范圍，并且每一個50bp左右的局部GC含量也不超過70%。如果目的基因GC含量過高，而突變位點(diǎn)不在高GC含量區(qū)域，可以先把該基因的不含高GC含量的一個區(qū)域克隆出來，進(jìn)行定點(diǎn)突變，然后再把突變后的片斷克隆回原基因中。如果必需使用高GC含量的質(zhì)粒模板，或者有局部高GC含量的質(zhì)粒模板，請另外使用專門用于高GC含量模板的PCR反應(yīng)試劑。
必須使用從dam⁺的大腸桿菌(這類菌中質(zhì)粒可以被甲基化)中抽提得到的質(zhì)粒用于基因定點(diǎn)突變。常用的大部分大腸桿菌都是dam⁺的，包括DH5α、JM109等。
4. 基因定點(diǎn)突變反應(yīng)：
a. 如下設(shè)置基因定點(diǎn)突變反應(yīng)體系：

按照上面的順序依次加入各種試劑。在上述反應(yīng)體系中，根據(jù)待突變模板質(zhì)粒的量，計算出需加入的Nuclease-Free Water的量，使總體積為49μl。適當(dāng)混勻后，加入1μlBeyoFusion™ DNA Polymerase，混勻。如果用的PCR儀沒有熱蓋，在反應(yīng)體系上加入一滴礦物油(mineral oil)以防止蒸發(fā)。
b. 按照如下參數(shù)設(shè)置PCR儀：

       說明：上面表格中30sec/kb表示，如果待突變的質(zhì)粒為6kb，那么68℃的延伸時間為3分鐘。60sec/kb的含義相同。
5. DpnI消化：
PCR反應(yīng)后，直接在PCR反應(yīng)體系中加入1μl DpnI，混勻后37℃孵育5min。37℃孵育可以在PCR儀上進(jìn)行，也可以在水浴鍋中進(jìn)行。DpnI消化完畢后可以直接用于轉(zhuǎn)化，或者-20℃保存?zhèn)溆谩?br /> 6. 轉(zhuǎn)化、挑克隆鑒定：
感受態(tài)細(xì)菌的轉(zhuǎn)化效率必需至少在10⁷以上，否則很難得到克隆。根據(jù)所使用的感受態(tài)細(xì)菌，加入盡量多的經(jīng)過DpnI消化后的突變產(chǎn)物用于轉(zhuǎn)化。通常每100μl感受態(tài)細(xì)菌中可以加入5-10μl經(jīng)過DpnI消化后的突變產(chǎn)物。按照所使用的感受態(tài)細(xì)菌的操作方法進(jìn)行操作，在涂板前通過離心濃縮的辦法，把所有被轉(zhuǎn)化后的細(xì)菌，全部涂布到含有適當(dāng)抗生素的平板上，培養(yǎng)過夜。通常會得到100個以下的克隆。如果發(fā)現(xiàn)有上千個克隆，那么通常是有什么地方出了問題。
對于得到的克隆，可以挑取3-5個克隆送樣測序去測序，以確認(rèn)得到的克隆是否是預(yù)期的突變克隆。通常大部分的是預(yù)期的突變克隆。但有時也可能會因?yàn)殡S機(jī)因素，會測序了3-5個克隆才得到一個預(yù)期的突變克隆。

常見問題：
1. 轉(zhuǎn)化后沒有克隆或克隆數(shù)極少：
a. 感受態(tài)細(xì)菌效率不夠高，請檢測一下感受態(tài)細(xì)胞的效率，確保轉(zhuǎn)化效率在10⁷以上，當(dāng)然高一些更好。
b. 把DpnI消化后的產(chǎn)物用常規(guī)的乙醇沉淀方法進(jìn)行沉淀，然后溶解在較小的體積中。這樣就可以把所有的產(chǎn)物全部用于轉(zhuǎn)化。
c. 優(yōu)化基因定點(diǎn)突變中的PCR參數(shù)?？梢园炎畛醯?5℃變性時間延長為5min，循環(huán)中95℃變性的時間延長至1min，把循環(huán)中的68℃的延伸時間改為1min/kb 至2min/kb，退火可以改為60-55℃或65-55℃等的touch down，退火時間也可以適當(dāng)延長。
d. 引物設(shè)計有問題。通過突變反應(yīng)中的PCR沒有很好地擴(kuò)增出預(yù)期的突變質(zhì)粒。
e. 如果使用礦物油(mineral oil)，在轉(zhuǎn)化時如果把礦物油帶入感受態(tài)菌，會嚴(yán)重影響轉(zhuǎn)化效率。
2. 有克隆，但沒有或很難檢測到預(yù)期的突變克?。?br /> a. DpnI消化效果不佳。一種可能是加入DpnI后，由于該酶在甘油中，會迅速下沉，如果沒有混勻就會嚴(yán)重影響DpnI的消化作用。另一種可能是DpnI由于保存不當(dāng)或保存時間過長等原因?qū)е禄钚韵陆担@時可以適當(dāng)延長消化的時間至1-2小時。
b. 使用的待突變的模板質(zhì)粒量過多，導(dǎo)致DpnI消化時不完全。我們這里推薦的模板質(zhì)粒用量0.5μg，已經(jīng)是模板質(zhì)粒用量的上限，不能再使用更多的模板質(zhì)粒了。
c. 盡量避免多次反復(fù)凍融dNTP?？梢园裠NTP適當(dāng)分裝后再使用。
3. 有突變克隆，但突變位點(diǎn)不是預(yù)期的位點(diǎn)：
a. 引物設(shè)計不佳，并且PCR反應(yīng)中退火溫度過低，導(dǎo)致引物退火到錯誤的地方。
b. 引物質(zhì)量較差，沒有經(jīng)過PAGE純化。這樣引物中通常會含有比設(shè)計的引物要短的特異性較差的引物，容易導(dǎo)致非預(yù)期的突變