T3 RNA Polymerase
T3 RNA Polymerase，即T3 RNA聚合酶，是一種高度特異識別T3啟動子序列的DNA依賴的5'→3'RNA聚合酶。T3 RNA
Polymerase可以催化單鏈或雙鏈DNA T3啟動子下游NTP的摻入，合成與T3啟動子下游的模板DNA互補(bǔ)的RNA。
特點(diǎn)：T3 RNA Polymerase可以識別修飾的NTP，例如生物素標(biāo)記、熒光素標(biāo)記的NTP，可以用于各種標(biāo)記RNA的合成。同時對于T3啟動子有高度的特異性。
用途：用于RNA合成，合成的RNA可以用于或用作：雜交探針，基因組DNA序列分析，核糖核酸酶保護(hù)測定(RNase
protection assay)，反義RNA合成，作為體外翻譯的RNA模板，RNA剪接研究的底物，RNA二級結(jié)構(gòu)和RNA-蛋白質(zhì)相互作用，核酸擴(kuò)增分析，siRNA、miRNA等小RNA。
來源：由大腸桿菌表達(dá)，表達(dá)基因?yàn)槭染wT3 RNA Polymerase基因。
活性定義： 37℃60分鐘內(nèi)，催化1nmol AMP摻入到多聚核苷酸中所需的酶量定義為1個活性單位。
活性檢測條件：40mM Tris-HCl(pH8.0)，6mM MgCl2，10mM DTT，2mM spermidine，0.5mM NTP，
0.6MBq/ml[3H]-ATP，20μg/ml plasmid DNA containing the specific T3 RNA Polymerase promoter sequence。
純度：不含DNA內(nèi)切酶和外切酶，不含RNA酶。
酶儲存溶液：50mM Tris-HCl(pH8.0)，150mM NaCl，5mM DTT，0.1mg/ml BSA，0.5mM Elugent，50% glycerol。
Transcription Buffer(5X)：200mM Tris-HCl(pH7.9 at 25℃)，30mM MgCl2，50mM DTT，50mM NaCl，10mM
spermidine。
失活或抑制：70℃加熱10分鐘可使T3 RNA Polymerase失活。加入適量EDTA也可以使T3 RNA Polymerase失活。螯合劑、濃度大于150mM的鈉、鉀或銨鹽可以顯著抑制T3 RNA Polymerase的活性。
T3的consensus promotersequence如下：
-15 -10 -5 +1 +5
AATTAACCCTCACTAAAGGGAGA
包裝清單：
XY-7066-1
T3 RNA Polymerase(20U/μl)
500U
XY-7066-2
Transcription Buffer(5X)
0.2ml
保存條件：
-20℃保存。
注意事項：
酶使用時宜存放在冰盒內(nèi)或冰浴上，使用完畢后宜立即放置于-20℃保存。
本產(chǎn)品僅限于專業(yè)人員的科學(xué)研究用，不得用于臨床診斷或治療，不得用于食品或藥品，不得存放于普通住宅內(nèi)。
為了您的安全和健康，請穿實(shí)驗(yàn)服并戴一次性手套操作。
使用說明：
1. RNA合成：
a. DNA模板經(jīng)限制性核酸內(nèi)切酶酶切線性化。
b. 酚/氯仿抽提DNA，用乙醇沉淀后，溶于適量的無菌去離子水中。本步驟也可以使用適當(dāng)?shù)腄NA純化試劑盒，例如信裕生物的
DNA純化試劑盒(D0033)，直接進(jìn)行純化，從而免去了酚氯仿抽提和乙醇沉淀這些步驟。
c. 參考如下表格設(shè)置反應(yīng)體系：
Transcription Buffer (5X)
10μl
NTP Mixture (10mM each)
10μl
Ribonuclease Inhibitor
50U
補(bǔ)充經(jīng)DEPC處理的去離子水
至50μl
d. 按上表設(shè)置好反應(yīng)體系后，輕輕混勻(可以用移液器吹打混勻或用Vortex在最低速度輕輕混勻)，隨后離心沉淀液體。
e. 37℃孵育1～2個小時。
f. 加入2μl 0.5M EDTA (pH 8.0)到反應(yīng)體系中混勻或-20℃冷卻終止反應(yīng)。
g. 電泳分析轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物，或通過其他適當(dāng)方法鑒定轉(zhuǎn)錄的效率。
注意：
a) 轉(zhuǎn)錄需在無RNA酶條件下進(jìn)行。
b) 反應(yīng)體系需在室溫條件下配置，4℃有亞精胺(spermidine)存在時DNA可發(fā)生沉淀。
c) 按以上反應(yīng)條件，每1μg 模板DNA可合成超過10μg 的RNA。
d) 如果模板DNA的線形化不太完全，會導(dǎo)致轉(zhuǎn)錄出比預(yù)期長度更長的RNA，同時使預(yù)期長度的轉(zhuǎn)錄本比例下降。
e) 可根據(jù)實(shí)際情況按照比例放大或縮小上述反應(yīng)體系。
2. 放射標(biāo)記RNA的合成：
a. DNA模板經(jīng)限制性核酸內(nèi)切酶酶切線性化。
b. 酚/氯仿抽提DNA，用乙醇沉淀后，溶于適量的無菌去離子水中。本步驟也可以使用適當(dāng)?shù)腄NA純化試劑盒，例如信裕生物的
DNA純化試劑盒(D0033)，直接進(jìn)行純化，從而免去了酚氯仿抽提和乙醇沉淀這些步驟。
c. 參考如下表格設(shè)置反應(yīng)體系：
Transcription Buffer (5X)
4μl
3 NTP Mixture (10mM each , without CTP)
1μl
[α-32P]-CTP, ～30TBq/mmol(800Ci/mmol)
1.85MBq(50μCi)
Ribonuclease Inhibitor
20U
補(bǔ)充經(jīng)DEPC處理的去離子水
至20μl
d. 37℃孵育1～2個小時。
e. -20℃冷卻終止反應(yīng)。
f. 分析和檢測RNA的標(biāo)記效率。
注意：
a) 按以上方法合成的RNA活性一般為3-5 x108dpm/μg。
b) 上述標(biāo)記反應(yīng)中也可以使用[32P]、[35S]或[3H]標(biāo)記的其他NTP。使用其他放射性標(biāo)記的NTP時，其他的NTP需作相應(yīng)調(diào)整。20μl反應(yīng)體系各成分推薦使用劑量分別為：1.85MBq(50μCi)5'-[α-32P]-CTP,～30TBq/mmol(800Ci/mmol)；11.1MBq(300μCi)5'-[α-35S]-UTP,>37TBq/mmol(>1000Ci/mmol)；0.925MBq(25μCi)5,6-[3H]-UTP,1.1-2.2TBq/mmol(30-60Ci/mmol)。
c) 放射性標(biāo)記NTP濃度低于12μM時，全長轉(zhuǎn)錄本合成效率也會下降。
3. 其它用途可以參考上述用途或相關(guān)文獻(xiàn)資料進(jìn)行。
關(guān)鍵字： T3 RNA Polymerase說明書；T3 RNA Polymerase廠家
上?？道噬锟萍加邢薰臼且患壹邪l(fā)、生產(chǎn)、銷售、服務(wù)于一體的一家生物科技企業(yè)，專營生化試劑、標(biāo)準(zhǔn)品、基因、蛋白、抗體、Elisa試劑盒、細(xì)胞生物學(xué)，分子生物學(xué)等高生物產(chǎn)品?？偛课挥谏虾＃⒃诒本?、廣東，江西，吉林等全國30多個省市設(shè)有分公司和代理機(jī)構(gòu)。涉及的產(chǎn)品被中國科學(xué)院、清華、北大、復(fù)旦，上海交大，復(fù)旦醫(yī)學(xué)院，上海中醫(yī)藥大學(xué)，華東師范大學(xué)，第二軍醫(yī)大學(xué)，曙光醫(yī)院，浦東新區(qū)人民醫(yī)院等知名科研院所廣泛使用，可靠而穩(wěn)定的質(zhì)量和完善的售后服務(wù)確。