細菌膜蛋白質微量提取試劑盒

產品及特點本試劑盒是基于超速離心的快速提取細菌膜蛋白的試劑盒。其原理是裂解細 胞后，通過超速離心分離出細胞膜和附著的蛋白質。跟傳統的密度梯度離心法和去 污劑法相比，本方法具有下列特點：

1. 一步式分離細胞膜和膜蛋白，密度梯度離心法簡單快捷。

2. 膜蛋白純度高，能夠去除各種胞漿蛋白的污染，也能去除松散附著在細胞膜上 的蛋白，所得膜蛋白主要是整合蛋白。

3. 膜蛋白完整性好，主要是由于實際中有抑制蛋白酶成分。

4. 回收效率高，一般能得到相當于總蛋白量 6%的膜蛋白。

5. 可用于 E. coli，S. typhimurium，K. aerogens，P. aeruginosa，C. crescentus 等細菌。 
規(guī)格及成分 成 分 編 號 大扁盒包裝
細菌細胞膜蛋白提取溶液 A LM100929a 125 mL
細菌細胞膜蛋白提取溶液 B LM100929b 25 mL
細菌細胞膜蛋白提取溶液 C LM100929c 250 mL
DNase I 干粉 131230 3.5 mg
使用手冊 100929sc 1 份

運輸及保存 常溫運輸和保存，但 DNase I 需要低溫運輸，-20℃保存。有效期一年。

自備試劑 膜蛋白溶解液（取決于后續(xù)實驗。如果后續(xù)實驗為 SDS-PAGE，則用 1× SDS-PAGE 上樣液作為溶解液；如果用于 2D 電泳，則使用 1×等電點電泳上樣 液作為溶解液）。 

使用方法

準備：一次使用本試劑盒時需要將所有 DNase I 干粉倒入溶液 B 中，輕柔顛倒 使 DNase 干粉溶解。未用完的部分需要放-20℃保存，好在一個月內完，否則 DNase 將逐漸失去活性。此外，好在實驗前 1 小時將溶液 B 冰浴預冷。 

用法一：小量制備（主要用于上樣量比較小的 SDS-PAGE 電泳等實驗）

1、 收集 20-40 mL 過夜培養(yǎng)的細菌飽和培養(yǎng)液（OD420 在 1.5 左右即可），2500 g 室溫離心 10 分鐘后棄上清。

2、 加入 2 mL 溶液 A，輕柔吹打，將細菌重懸于溶液 A 中。

3、 2500 g 室溫離心 10 分鐘后棄上清。 4、 加入 0.5 mL 溶液 B（必須已經提前加入了 DNase I 干粉），輕柔吹打使細菌 重懸。注：如果細菌起始量沒有 20-40 mL，溶液 A 的用量可以等比例降低。 重懸在溶液 A 中的細菌可以放-80℃長期保存。 

5、 用超聲或 French Press 方法裂解細胞。如果用 French Press 方法，則需要 處理至少兩次，每次的壓力為 9.65×10E7（=14000 psi）。注意：不論用哪 種裂解方法，都必須在顯微鏡下檢查細菌是否已經裂解，否則還需要重復細菌 裂解過程，直到 80%以上的細菌都裂解為止。

6、 2500g 室溫離心 8 分鐘后小心轉移上清到新的 10 mL-15 mL 塑料離心管中 （如 Beckman Optima 臺式超速離心機離心管），棄沉淀（未破裂細胞）。

7、 在上清（細菌裂解液）中加入 5 mL 預冷的溶液 C，輕柔顛倒混勻后冰浴放置 30-60 分鐘。其間可以輕柔顛倒混勻 3-5 次。

8、 用 Bechman Optima 臺式超速離心機 115，000g 4℃離心 60 分鐘。也可以 使用其他冷凍超速離心機，但離心力應該一致，否則有可能得不到沉淀。

9、 小心移棄上清，在沉淀中加入 0.2 mL 溶液 A，充分吹打混勻。

10、用 Beckman Optima 臺式超速離心機 115，000g 4℃離心 60 分鐘。也可 以使用其他冷凍超速離心機，但離心力應該一致，否則有可能得不到沉淀。 11、小心移棄上清，所得沉淀放-20℃長期保存，也可以直接加入 0.1 mL 自備的， 跟后續(xù)實驗兼容的緩沖液（如 1×SDS-PAGE 上樣液中，可從本公司購買）， 所得膜蛋白的濃度將在 1mg/mL 左右。

用法二：大量制備（主要用于上樣量比較大的 2D 電泳等實驗） 

1、 收集 200-400 mL 過夜培養(yǎng)的細菌飽和培養(yǎng)液（OD420 在 1.5 左右即可），2500 g 室溫離心 10 分鐘后棄上清。

2、 加入 20 mL 溶液 A，輕柔吹打，將細菌重懸于溶液 A 中。

3、 2500 g 室溫離心 10 分鐘后棄上清。

4、 加入 5 mL 溶液 B（必須已經提前加入了 DNase I 干粉），輕柔吹打使細菌重懸。注：如果細菌起始量沒有 200-400 mL，溶液 A 的用量可以等比例降低。重懸在溶液 A 中的細菌可以放-80℃長期保存。

5、 用超聲或 French Press 方法裂解細胞。如果用 French Press 方法，則需要處理至少兩次，每次的壓力為 9.65×10E7（=14000 psi）。注意：不論用哪種裂解方法，都必須在顯微鏡下檢查細菌是否已經裂解，否則還需要重復細菌裂解過程，直到 80%以上的細菌都裂解為止。

6、 2500g 室溫離心 8 分鐘后小心轉移上清到干凈的玻璃燒杯中，棄沉淀（未破裂細胞）。

7、 在上清（細菌裂解液）中加入 50 mL 預冷的溶液 C，輕輕在冰浴中攪拌混勻30-60 分鐘。注：可以在大燒杯中裝冰，然后將裝有樣品的小燒杯放入，在放

入干凈的攪拌子，以低速度攪拌。

8、 用 Beckman Type 55.2 Ti 轉頭 115，000g 4℃離心 60 分鐘。也可以使用其他冷凍超速離心機，但離心力應該一致。

9、 小心移棄上清，在沉淀中加入 2 mL 溶液 A，充分吹打混勻。

10、用 Beckman Type 55.2 Ti 轉頭 115，000g 4℃離心 60 分鐘。也可以使用其他冷凍超速離心機，但離心力應該一致。

11、小心移棄上清，所得沉淀放-20℃長期保存或溶解在 1 mL 自備的，跟后續(xù)實驗兼容的緩沖液（如 1×等電點電泳上樣液，可從本公司購買），所得膜蛋白的濃度在 1mg/mL 左右。