農(nóng)桿菌EHA101感受態(tài)細(xì)胞

產(chǎn)品及特點(diǎn)EHA101 菌株為 C58 型背景，核基因中含有篩選標(biāo)簽——利福平抗性基因 rif，為了便于轉(zhuǎn)化操作，此菌株攜帶一無自身轉(zhuǎn)運(yùn)功能的胭脂堿型 Ti 質(zhì)粒 pEHA101 (pTiBo542DT-DNA)，此質(zhì)粒含有 vir 基因，vir 基因是 T-DNA 插 入植物基因組必需的元件。pEHA101 (pTiBo542DT-DNA)質(zhì)粒自身的 T-DNA 轉(zhuǎn)移功能被破壞，但可以幫助轉(zhuǎn)入的雙元載體 T-DNA 順利轉(zhuǎn)移。pEHA101 (pTiBo542DT-DNA) 型 Ti 質(zhì)粒含有篩選標(biāo)簽：kan，賦予 EHA101 菌株卡那 霉素抗性，適用于玉米、水稻、煙草等植物的轉(zhuǎn)基因操作。本公司生產(chǎn)的 EHA101 化學(xué)轉(zhuǎn)化感受態(tài)細(xì)胞經(jīng)特殊工藝制作，pK7WGF2 質(zhì)粒（壯觀霉素抗性）檢測 轉(zhuǎn)化效率>104cfu/μg DNA。EHA101 農(nóng)桿菌的基因型是：C58 (rifR) Ti pEHA101 (pTiBo542 D T-DNA)(kanR) Nopaline 
規(guī)格及成分 成分 編號 10 支包裝
EHA101 農(nóng)桿菌感受態(tài)細(xì)胞 161205A 10×100 μL
pKWGF2（10ng/uL） LM161205B 10 μL
使用手冊 1 份

運(yùn)輸及保存 干冰運(yùn)輸，-80℃保存，有效期一年。

自備試劑 質(zhì)粒 DNA、液氮等

使用方法 轉(zhuǎn)化前準(zhǔn)備

1. 冰水浴和 37℃水浴。

2. 液氮或干冰/乙醇混合物。

3. 將抗性平板在 28℃培養(yǎng)箱中平衡至少 15 分鐘。

轉(zhuǎn)化方法

1. 取-80℃保存的農(nóng)桿菌感受態(tài)于室溫或手心片刻待其部分融化，處于冰水混合狀態(tài)時插入冰中。

2. 每 100μL 感受態(tài)加 1μg（體積不大于 10 μL）質(zhì)粒 DNA，用手撥打管底混勻，依次于冰上靜置 5 分鐘、液氮 5 分鐘、37℃水浴 5 分鐘、冰浴 5 分鐘。

3. 加入 700μL 無抗生素的 LB 或 YEB 液體培養(yǎng)基，于 28℃振蕩培養(yǎng) 2~3 小時。

4. 6000rpm 離心一分鐘收菌，留取 100μl 左右上清輕輕吹打重懸菌塊涂布于含相應(yīng)抗生素的 LB 或 YEB 平板上，倒置放于 28℃培養(yǎng)箱培養(yǎng) 2-3 天（當(dāng)平板只含有轉(zhuǎn)化所用雙元載體抗生素時，28℃培養(yǎng) 48 小時即可；平板中同時加入雙元載體抗生素，20 μg/ml rif 時，需 28℃培養(yǎng) 60 小時；如果使用的平板含有 50 μg/ml rif 則需要 28℃培養(yǎng) 72-90 小時）。

注意事項(xiàng)

4. 加入質(zhì)粒時體積不應(yīng)大于感受態(tài)體積的 1/10；質(zhì)粒不純或存在乙醇等有機(jī)物污染，轉(zhuǎn)化效率急劇下降；質(zhì)粒增大一倍，轉(zhuǎn)化效率下降一個數(shù)量級。

5. 混入質(zhì)粒時應(yīng)輕柔操作。轉(zhuǎn)化高濃度的質(zhì)?？上鄳?yīng)減少最終用于涂板的菌量。

6. 平板上陽性克隆密度過大時，由于營養(yǎng)不足，陽性克隆生長變慢，菌落變小，為了獲得大的菌落，應(yīng)減少質(zhì)粒用量。

7. 利福平濃度不應(yīng)高于 25 μg/mL，過高的利福平濃度不利于農(nóng)桿菌生長，會降低其生長速度和轉(zhuǎn)化效率。本公司 EHA101 感受態(tài)計(jì)算轉(zhuǎn)化效率時所用平板只含有 50 μg/mL kan，若所用平板含有 20 μg/mL rif 則轉(zhuǎn)化效率降低到 1/2。

8. 培養(yǎng)基中加入利福平的目的是防止雜菌生長、篩選農(nóng)桿菌；根據(jù)所用菌株抗性加入鏈霉素或慶大霉素可防止 Ti 質(zhì)粒丟失，但鏈霉素不利于農(nóng)桿菌的轉(zhuǎn)基因操作，所以一般培養(yǎng)農(nóng)桿菌時不考慮鏈霉素或慶大霉素，Ti 質(zhì)粒丟失的概率極低(可以忽略)。