一步式探針法qRT-PCR試劑盒

產(chǎn)品及特點本產(chǎn)品是基于熒光探針檢測的即用型 RT-PCR 試劑盒，可以對靶 RNA 分子進行實時定量

RT-PCR 分析（quantitative RT-PCR、qRT-PCR）。產(chǎn)品含有經(jīng)過優(yōu)化的緩沖液組分、逆轉(zhuǎn)

錄酶、熱啟動 Taq DNA 聚合酶、Taq DNA 穩(wěn)定劑、dNTPs、MgCl2和穩(wěn)定劑等所有實時定

量 RT-PCR 所需要的成分，用戶只需加入 RNA 模板、引物和探針即可進行探針法實時定量

RT-PCR 反應(yīng)，具有廣泛的用途。本產(chǎn)品具有下列特點：

1. 以 2×Mix 提供，用戶只需準(zhǔn)備模板、引物、探針和 ROX 染料（取決于 qPCR 儀器）即

可以進行探針法實時定量 RT-PCR 實驗，非常方便快捷，降低了操作誤差。

2. 各成分的濃度和比例都經(jīng)過精心優(yōu)化，反應(yīng)的靈敏度高，特異性強。靈敏度最高時可以達(dá)

到 50 拷貝/反應(yīng)（跟模板質(zhì)量，引物設(shè)計等相關(guān)）。

3. 既可用于TaqMan探針qRT-PCR，也可以是分子信標(biāo)（molecular beacon）的qRT-PCR。

4. 靈敏度和專一性比染料法熒光定量 RT-PCR 更高。

5. 可用于基因表達(dá)分析、SNP 分析、拷貝數(shù)分析等實驗。也可以用于定性檢測。

6. 本產(chǎn)品只能用于科研，1mL 足夠 100 次 20uL 體系的探針法 qRT-PCR 反應(yīng)。
規(guī)格及成分 1 mL 規(guī)格成 份 編 號 塑料袋包裝
2×探針法 qRT-PCR 緩沖液 LM190504a 1 mL（橙色蓋）
5×探針法 qRT-PCR 酶混合液 LM190504b 0.2 mL（紅色蓋）
使用手冊 LM190504sc 1 份
10mL 規(guī)格
成 份 編 號 十孔盒包裝
2×探針法 qRT-PCR 緩沖液 190504a 1 mL×10（橙色蓋）
5×探針法 qRT-PCR 酶混合液 190504b 0.2 mL×10（紅色蓋）
使用手冊 190504sc 1 份

運輸及保存 低溫運輸，-20℃保存, 不凍融時保存期限為 12 個月。如果需要每天使用，可在 4℃放置三周。

自備試劑 RNA 模板、引物、TaqMan 探針、超純水。

使用方法

1. 如果有 N 個樣品并且做定量分析，設(shè)置 N+7 個反應(yīng)，多出的 7 個中，6 個是做標(biāo)準(zhǔn)

曲線的陽性對照，一個是陰性對照（NC）。在 N+7 個 PCR 管中，加入下列成分。如果是

做定性分析，則 6 個做標(biāo)準(zhǔn)曲線的樣品縮減成一個陽性對照（PC），用戶自己需要根據(jù)下

表進行適當(dāng)修改（把 6 個標(biāo)曲

2×探針法 qRT-PCR 緩沖液 各 10 uL 各 10 uL 10 uL

自備引物 1（10uM） 各 1 uL 各 1 uL 1 uL

自備引物 2（10uM） 各 1 uL 各 1 uL 1 uL

N 個自備模板 RNA 各 1-2 uL 不加 不加

自備陽性對照模板（6 個梯度） 不加 各 1 uL（1 管

加 1 個梯度） 不加

陰性對照模板（水） 不加 不加 1 uL

自備探針（0.5uM） 各 1 uL 各 1 uL 1 uL

自備 50×ROX I 染料

或

自備 50×ROX II 染料（見注）

各 0.4 uL 各 0.4 uL 0.4 uL

5×探針法 qRT-PCR 酶混合液 2 uL 2 uL 2 uL

補超純水到 20 uL 20 uL 20 uL

注，下列信息僅供參考，具體以 qPCR 儀器的使用手冊為準(zhǔn)。

1、不需要 ROX 的機型：Agilent MX3000 和 MX4000、iCycler IQ、LightCycler 480、，、

Smart Cycler System、Thermal Cycler Dice Real Time System 等型號的熒光 PCR 儀器

不需要加 ROX 染料，但加入的話也不會影響整個 PCR 分析。

2、需要使用 ROX I 的機型：ABI Prism7000、7300、7700、7900HT、Step One、Step

One Plus。

3、需要使用 ROX II 的機型：ABI Prism7500、7500 Fast、MJ Opticon、MJ Chromo4、

Corbett RotorGene 3000。

2. 放入熒光 PCR 儀中進行擴增, 下表的擴增參數(shù)僅供參考，一定需要根據(jù)靶分子長度，引物

和探針的 Tm 值、標(biāo)記染料的種類等進行調(diào)節(jié)。一般選擇三步法 PCR：

步驟 反應(yīng)參數(shù) 備注

逆轉(zhuǎn)錄（RT 步驟） 94℃ 30 分鐘

預(yù)變性 94℃ 2 分鐘

PCR（35-45 次循環(huán)）

94℃ 15 秒

靶分子 長 度 最 好 在

80-200bp

55-65℃ 15-30 秒

在此步采集熒光信號，通

道根據(jù)標(biāo)記染料決定

72℃ 30 秒

如果引物 Tm 值接近 60℃，也可以選擇兩步法 PCR：

步驟 反應(yīng)參數(shù) 備注

逆轉(zhuǎn)錄（RT 步驟） 94℃ 30 分鐘

預(yù)變性 94℃ 2 分鐘

PCR（35-45 次循環(huán)）

94℃ 15 秒

靶分子 長 度 最 好 在

80-200bp

60℃ 30-60 秒

在此步采集熒光信號，通

道根據(jù)標(biāo)記染料決定

3. 數(shù)據(jù)處理

如果把本試劑盒用于定量檢測，則以陽性對照濃度的 log 值為橫軸，以 Ct 值為縱軸，繪

制標(biāo)準(zhǔn)曲線。再以待測樣品的 Ct 值從標(biāo)準(zhǔn)曲線上推算出樣品 DNA 濃度的 log 值，再推算

出其濃度。

如果把本試劑盒用于定性檢測，只判斷陽性或陰性。一般情況下，陰性對照 Ct 大于或等

于 40（閾值需要以陰性對照的 Ct 值確定，此處為便于敘述以 40 為例，具體情況很可能

閾值不一樣）。陽性對照必須有熒光對數(shù)增長，有典型擴增曲線，Ct 值應(yīng)該小于或等于 30。

對待測樣品，如果其 Ct 大于或等于 40 則為陰性，如果小于或等于 35 則為陽性。如果在

35-40 之間，則重復(fù)一次。重復(fù)實驗的 Ct 值如果大于或等于 40 則為陰性，如果小于 40，

則為陽性。