柱式植物線粒體DNAout

產(chǎn)品及特點(diǎn) 植物線粒體是重要的植物細(xì)胞器，負(fù)責(zé) ATP 的產(chǎn)生。此外植物很多重要的特性(如雄性不育)也跟線粒體相關(guān)，是母系遺傳研究的重要材料。對(duì)植物線粒體進(jìn)行遺傳研究需要進(jìn)行線粒體DNA純化。本產(chǎn)品就是專門用于植物細(xì)胞線粒體DNA純化的試劑盒，它具有下列特點(diǎn)：

1. 即用型試劑盒，用戶不需要單獨(dú)配制各種溶液。

2. 提供粗提和精提兩種操作方案，粗提利用常規(guī)臺(tái)式冷凍離心機(jī)的差速分離原理進(jìn)

行線粒體粗提，所得線粒體含少量其他細(xì)胞器污染，可用于后續(xù)的 PCR 級(jí)別的

線粒體 DNA 提取。

3. 精提利用冷凍超速離心（離心力達(dá) 40000g）制備的密度梯度來(lái)將粗提制備的線粒體和其他細(xì)胞成分進(jìn)一步分開，得到線粒體精提液，適用于后續(xù)的測(cè)序級(jí)別的線粒體 DNA 提取。

4. 本產(chǎn)品足夠 5 次提取，每次可處理 10g 綠色植物組織（可得 1-2.5 mg 左右線粒

體）或 20g 非綠色植物組織（可得 2-5 mg 左右的線粒體）。
規(guī)格及成分 成 分 編號(hào) 大紙盒包裝 
植物線粒體提取勻漿液 111208a 250 mL
植物線粒體提取洗滌液 111208b 250 mL×2
植物線粒體提取離心介質(zhì)溶液 111208c 150 mL
Percoll 17-0891-09 50 mL
BSA 干粉 9048-46-8 10g
帶柄尼龍篩 111208d 1 個(gè)
軟毛筆 111208e 1 只
詹納斯綠 B 染色液（0.2%） 111207d 1 mL
DNase A 干粉 101004a 1 mg
細(xì)胞器 DNA 純化溶液 A 180702a 3 mL
細(xì)胞器 DNA 純化溶液 B 180702b 750 uL
使用手冊(cè) 180702sc 1 份  

運(yùn)輸及保存 常溫運(yùn)輸和保存, 保存期限一年。

自備試劑 超純水、5 M KOH（調(diào) pH 用），25mM MgCl2溶液、0.5M EDTA 溶液、氯仿、異

丙醇、75%乙醇、TE 緩沖液或超純水。

使用方法 注意：線粒體膜對(duì)溫度高度敏感，所以整個(gè)操作必須在冰上或者在冷室進(jìn)行，所用植

物組織，器皿和溶液均需要在 4℃預(yù)冷。任何情況下線粒體的溫度都不要超過(guò) 4℃。

一：選擇植物組織

1. 植物組織不同，線粒體產(chǎn)率不同，請(qǐng)以下表為參考：

植物組織種類 線粒體產(chǎn)率 說(shuō)明

根和塊莖 0.3 mg/10g 如土豆，紅薯等

黃化苗（下胚軸、子葉、胚芽鞘） 2-5 mg/10g 多酚含量低于葉片

有光合作用的葉片和子葉 1-2.5 mg/10g 需放置在暗處 3 天

2. 一般純化好選用黃化苗。如果用綠色組織（如葉片），需將植物提前放在暗室

至少 3 天以降低淀粉含量，否則淀粉顆粒將干擾線粒體的純化。

3. 一次實(shí)驗(yàn)需要 10g 綠色植物組織（或 20 g 干凈的非綠色植物組織）、40 mL 勻

漿液、約 90 mL 洗滌液和 35 mL 密度梯度離心介質(zhì)（密度梯度離心介質(zhì)的配制

方式是一次性將 9.8g =8.7mLPercoll 加入到 26.3mL 本試劑盒提供的離心介質(zhì)

溶液中，充分混勻后得到 35mL 密度梯度離心介質(zhì)）。上述三種溶液用前均需要

加入 BSA 干粉使其終濃度為 0.1%（100mL 溶液加 0.1g BSA 干粉，輕柔顛倒

混勻或攪拌溶解后放冰上預(yù)冷待用）。每次實(shí)驗(yàn)用多少配多少，不要預(yù)先將所有

BSA 干粉加入，否則容易長(zhǎng)菌。

二：線粒體粗提操作流程

4. 將 10 g 的綠色植物組織（去葉脈后的嫩葉子、愈傷組織）或 20 g 干凈的非綠色

植物組織（如發(fā)芽組織、根、塊莖等）浸泡在冰水中 10 分鐘，取出用紙吸干液

體后浸泡在預(yù)冷的 40 mL 勻漿液（已加 0.1% BSA）中，在浸泡狀態(tài)下剪成 1cm2

大小的碎片。注意：處理樣品量太大的話線粒體產(chǎn)率會(huì)急劇降低，所以如果同一

樣品太多可分成多組平行處理，得到線粒體粗提物后再匯集，

5. 將勻漿液和其中的植物組織碎片轉(zhuǎn)移到 Waring 勻漿器中，中速勻漿 3 次，每次

15 秒，每次之間間隔 10 秒以便讓碎片沉淀到刀片處。也可使用研磨法，具體操

作是將勻漿液和其中的植物組織碎片轉(zhuǎn)移到預(yù)冷的研缽中，研磨 3-4 分鐘。注意：

植物組織勻漿后釋放的物質(zhì)會(huì)使勻漿液酸化，降低 pH，而線粒體對(duì) pH 變化非

常敏感，因此建議勻漿后用 pH 試紙檢測(cè)勻漿液的 pH，如果低于 7.0，必須用自

備的 5 M KOH 將 pH 調(diào)到 7.0 以上才進(jìn)入下一步。

6. 用帶柄尼龍篩過(guò)濾勻漿液，穿透液可通過(guò)預(yù)冷的漏斗收集到預(yù)冷的 50 mL 的塑

料離心管中。帶柄尼龍篩可以洗干凈后可以反復(fù)使用。

7. 在低速固定角度冷凍離心機(jī)上 4℃ 1000 g 離心 5 分鐘，沉淀為未破碎的細(xì)胞、破碎細(xì)胞的碎片、細(xì)胞核和淀粉顆粒，上清含線粒體。小心轉(zhuǎn)移上清到新的預(yù)冷的 50mL 塑料離心管中。

8. 將裝上清的離心管在水平冷凍離心機(jī)上 4℃ 12,000 g 離心 20 分鐘，棄上清液，所得棕綠色沉淀即為純化的線粒體粗提物。有時(shí)沉淀底部還有白色的淀粉沉淀，屬于正?，F(xiàn)象。

9. 加入 10 mL 預(yù)冷的洗滌液（已加 0.1% BSA，下同）中，用軟毛筆輕柔重懸線粒體沉淀(如果底下有白色淀粉沉淀，需要避免重懸之)。不能劇烈震蕩，否則線粒體容易破裂。

10. 將線粒體重懸液轉(zhuǎn)移到新的 50mL 離心管中，再加入 30mL 預(yù)冷的洗滌液，4℃1000 g 離心 5 分鐘。線粒體將在上清中。

11. 將上清轉(zhuǎn)移到新的預(yù)冷的 50mL 離心管中，4℃ 12000 g 離心 20 分鐘，沉淀為線粒體。小心棄上清。到此步時(shí)，線粒體回收率一般在 15-30%。

12. 在沉淀中加入 2 mL 預(yù)冷的洗滌液。用軟毛筆輕柔重懸，得到線粒體粗提液。如果有平行提取，可將最多 4 管線粒體沉淀重懸在 2 mL 洗滌液中。線粒體粗提液中線粒體的回收率一般在 45-75%。

13. 在顯微鏡下檢測(cè)上清液中線粒體的完整性。具體做法是先滴 50uL 左右的線粒體粗提液到載玻片上，再滴入 50 uL 詹納斯染液綠 B 染色液 20 分鐘，油鏡下觀察，藍(lán)綠色顆粒狀物即為線粒體。

14. 所得線粒體粗提液含其他細(xì)胞器（如類囊體膜, 質(zhì)體, 過(guò)氧化物酶體， 乙醛酸循環(huán)體,或細(xì)菌）污染，但可直接用于 PCR 級(jí)線粒體 DNA 和 RNA 的提取。如果需要長(zhǎng)期保存，則直接放-80℃保存。如此保存的線粒體 DNA 完整性在幾年內(nèi)都不

會(huì)發(fā)生變化。

三：細(xì)胞核 DNA 的去除（純化測(cè)序級(jí)的線粒體 DNA 才需要進(jìn)行此操作）

15. 預(yù)留 50uL 線粒體粗提液做對(duì)照，在約 2 mL 剩余的線粒體粗提液中加入 40 uL25mM 自備的 MgCl2，再加入 0.2mg DNase 干粉，混勻后冰上放置 60 分鐘降解 DNA。取少量樣品（如 50uL）在 PCR 儀器中加熱到 95℃變性 10 分鐘滅活 DNase，再取其中的 10uL 和 10uL 預(yù)留的樣品一起進(jìn)行細(xì)胞核基因?qū)Ｒ恍訮CR（需要用戶自己設(shè)計(jì)引物和自備 PCR 試劑），如果 DNase 處理過(guò)的樣品沒(méi)有擴(kuò)增，而預(yù)留樣品有擴(kuò)增，則表明 DNA 去除比較干凈（達(dá)到 PCR 檢測(cè)的極限），則進(jìn)入下一步。如果未去除干凈，則繼續(xù)在冰上放置，直到 PCR 檢測(cè)不到細(xì)胞核 DNA。

16. 加入 0.32 mL 預(yù)冷的自備 0.5M 的 EDTA 溶液和 40mL 預(yù)冷的洗滌液。

17. 4℃ 1000 g 離心 5 分鐘，將上清轉(zhuǎn)移到新的預(yù)冷的 50mL 離心管中，4℃ 12000g 離心 20 分鐘，沉淀為去除細(xì)胞核 DNA 的線粒體。重懸在 2mL 洗滌液中。

18. 在顯微鏡下檢測(cè)上清液中線粒體的完整性。具體做法是先滴 50uL 左右的線粒體粗提液到載玻片上，再滴入 50 uL 詹納斯染液綠 B 染色液 20 分鐘，油鏡下觀察，藍(lán)綠色顆粒狀物即為線粒體。

四：線粒體精提操作方案（需要 40000g 的超速冷凍離心機(jī)）

19. 在 50 mL 預(yù)冷的塑料離心管中先后加入 35 mL 預(yù)冷的密度梯度離心介質(zhì)（配制方法見(jiàn)第三步，用前需先加 0.1% BSA）。

20. 將 2 mL 線粒體粗提物重懸液鋪在密度梯度離心介質(zhì)上。

21. 在超速水平離心機(jī)上 4℃ 40,000 g 離心 45 分鐘，最上層為黃色或橙色的質(zhì)體帶（如果材料是綠色植物，此帶將是綠色），其下的白色不透明的帶即為線粒體，管底沉淀為過(guò)氧化物酶體。其示意圖如下：

22. 用廣口吸管（可將 1 mL 藍(lán)搶頭中間剪斷后使用）收集線粒體帶，注意避開其上的質(zhì)體帶過(guò)氧化物酶體沉淀，估計(jì)所取含線粒體溶液的體積。

23. 在 15-20 分鐘的時(shí)間內(nèi)緩慢加入至少 4 倍體積的預(yù)冷的洗滌液。

24. 轉(zhuǎn)入 50 mL 塑料管離心管中，在冷凍離心機(jī)上 4℃ 15,000 g 離心 20 分鐘，沉淀為線粒體。可以直接進(jìn)入第 25 步進(jìn)行 DNA 提取。如果暫時(shí)不提取 DNA，則把線粒體沉淀放-80℃保存。

五：線粒體 DNA 的提取

25. 在線粒體沉淀中加入 600 uL 預(yù)熱的細(xì)胞器 DNA 提取溶液 A，用移液槍充分吹打均勻。

26. 再加入 150 uL 65℃預(yù)熱的細(xì)胞器 DNA 提取溶液 B，顛倒數(shù)次混勻。此時(shí)溶液中可能有白色絲狀懸浮物產(chǎn)生。由于溶液 B 比較粘稠，可以采取稱量方法取用，150 uL 約等于 150-160 mg。也可以將 1 mL 槍頭剪去一截再吸取。

27. 65℃放置 5 分鐘。不能室溫放置，否則 DNA 產(chǎn)量會(huì)降低 10-20%。

28. 加入 200 uL 自備氯仿，渦旋震蕩混勻 30 秒，此時(shí)溶液將呈乳白色。

29. 14000 g 室溫離心 2 分鐘。此時(shí)上清液將變得透明，中間層有白膜。小心轉(zhuǎn)移上清液到一個(gè)新的 1.5 mL 塑料離心管中，避免觸及中間層的白膜。

30. 加入 1 倍體積(約 750 uL)的異丙醇到上清液中，用手上下顛倒 30 秒混勻。此時(shí)一般將有絮狀 DNA 沉淀出現(xiàn)。

31. 14000 g 室溫離心 3 分鐘。此時(shí)管底將有微小 DNA 沉淀，小心棄上清，注意不要丟棄 DNA 沉淀。

32. 在離心管中加 1 mL 75%乙醇，短暫震蕩，14000 g 室溫離心 3 分鐘，棄上清。

33. 重復(fù)上述 75%乙醇洗滌操作一次。

34. 短暫離心，小心吸棄殘留的液體（約 50 μL）。此步不要省略，否則殘留的液體（含乙醇）將會(huì)影響 DNA 電泳、酶切很 PCR 等反應(yīng)。

35. 立即加入 50-100 μL TE 緩沖液或超純水充分溶解線粒體 DNA 沉淀。

36. 直接取 5-10 uL 電泳檢測(cè) DNA，再測(cè) OD 計(jì)算濃度和純度，其余樣品放-20℃保存?zhèn)溆谩?/p>