一站式平末端克隆試劑盒
產(chǎn)品及特點 本產(chǎn)品是一種能使 DNA 片段的末端平滑化、5’端的磷酸化、DNA 片段 和載體的連接等諸反應(yīng)高效快速完成的試劑盒。它具有下列特點：
1. 適用范圍包括：由高保真 DNA 聚合酶如 Pfu、Pwo、DeepVent 等擴(kuò)增 而來的 PCR 產(chǎn)物；一些限制性內(nèi)切酶如 EcoRV、SmaI 等酶切產(chǎn)生的 DNA 片段；粘端 DNA 用 DNA 聚合酶補平后的片段。
2. DNA 片段的末端平滑化反應(yīng)和 5’端的磷酸化反應(yīng)可在一個反應(yīng)體系中同 時進(jìn)行，反應(yīng)時間只需 10 min。
3. 本試劑盒中還含有高效的 DNA 連接液，可在短時間內(nèi)完成連接反應(yīng)。
一站式平末端克隆試劑盒
規(guī)格及成分 成 份 編號 十孔盒包裝
10×末端平滑化/磷酸化緩沖液 131126a 40 μL（紅蓋）
末端平滑化/磷酸化 Mix 131126b 20 μL（白蓋）
連接反應(yīng)溶液 131126c 120 μL（綠蓋）
超純水 100935 400 μL（黃蓋）
使用手冊 131126sc 1 份
一站式平末端克隆試劑盒運輸及保存 低溫運輸，-20℃保存，保存期限為一年。 自備試劑 DNA 片段等。
使用方法 一、用 PCR 反應(yīng)液直接進(jìn)行克隆時 :
Blunting Kination 反應(yīng)
1. 在微量離心管中配制下列反應(yīng)液。
試劑 使用量
PCR 反應(yīng)液 2 μL
10×末端平滑化/磷酸化緩沖液 2 μL
末端平滑化/磷酸化 Mix 1 μL
超純水 15 μL
2. 37℃反應(yīng) 10 min。
3. 70℃熱處理 5 min。
Ligation 反應(yīng)
4. 取 3. 的溶液 5 μL 到另一個新的微量離心管中。
5. 加入 1 μL 經(jīng)過去磷酸化處理的平滑末端載體 DNA（50-100 ng/μL），
混合均勻。
6. 加入 6 μL 的連接反應(yīng)溶液（連接反應(yīng)溶液請于冰中融解，使用前混勻。
應(yīng)避免多次反復(fù)凍融。），混合。
7. 16℃反應(yīng) 1 h。
8. 全量轉(zhuǎn)化 100 μL 的感受態(tài)細(xì)胞。
注意：用電刺激法做細(xì)菌轉(zhuǎn)化時，先用乙醇沉淀或苯酚抽提等方法置換
DNA 溶解緩沖液后再進(jìn)行電轉(zhuǎn)化；PCR 產(chǎn)物中混有非特異性 DNA 時，可
以通過瓊脂糖凝膠電泳回收目的 DNA 片段；PCR 反應(yīng)液最適用量 2 μL，
用量過多會降低反應(yīng)效率。如需提高 DNA 用量請用乙醇沉淀法精制 DNA
片段后再進(jìn)行反應(yīng)。
二、用精制后的 DNA 片段進(jìn)行克隆時 ：
Blunting Kination 反應(yīng)
9. 在微量離心管中配制以下反應(yīng)液。
試劑 使用量
DNA 片段 0.2-20 pmol
10×末端平滑化/磷酸化緩沖液 2 μL
末端平滑化/磷酸化 Mix 1 μL
超純水 up to 20 μL
10. 37℃反應(yīng) 10 min。
11. 70℃熱處理 5 min。
Ligation 反應(yīng)
12. 取 11. 的溶液 5 μL 到另一個新的微量離心管中。
13. 加入 1 μL 經(jīng)過去磷酸化處理的平滑末端載體 DNA（50-100 ng/μL）混
合均勻。
14. 加入 6 μL 的連接反應(yīng)溶液，混合。
15. 16℃反應(yīng) 1 h。
16. 全量反應(yīng)液用于轉(zhuǎn)化 100 μL 的感受態(tài)細(xì)胞。
注意：用電刺激法做細(xì)菌轉(zhuǎn)化時，先用苯酚抽提和乙醇沉淀等方法置換
DNA 溶解緩沖液后再進(jìn)行電轉(zhuǎn)化；插入 DNA 與載體 DNA 的摩爾數(shù)比應(yīng)
為 2﹕1-10﹕1。