SuperTOPO-Amp平末端克隆試劑盒

產(chǎn)品及特點(diǎn) 本產(chǎn)品是基于 Topoisomerase 能夠在幾秒鐘之內(nèi)高速連接 DNA 片段的原理開(kāi)發(fā)的無(wú)背景克隆試劑盒，它使用了本公司通過(guò)定點(diǎn)突變改良的 TOPO酶，連接效率比野生型更高。本試劑盒具有下列特點(diǎn)：

1. 高效快速，連接反應(yīng)幾乎在幾秒鐘內(nèi)完成，連接率幾乎達(dá)到 100。

2. 適用于 pfu、KOD 等高保真聚合酶擴(kuò)增的平末端片段的克隆。

3. 無(wú)雜帶或引物二聚體的PCR 擴(kuò)增產(chǎn)物可以不經(jīng)過(guò)純化直接用于連接反應(yīng)。

4. 零背景，無(wú)需 IPTG-X-Gal 藍(lán)白斑篩選，故不需要 IPTG-X-Gal 培養(yǎng)基。

5. 本試劑盒按 10 uL 標(biāo)準(zhǔn)反應(yīng)體系，有 25 次和 50 次兩種規(guī)格包裝供選擇。

6. 提供含 Amp 和 Kan 兩種抗性的載體供選擇（160684-25A/50A 是含Amp 抗性 TOPO 載體，160684-25K/50K 是含 Kan 抗性 TOPO 載體）。
規(guī)格及成分 成 份 編 號(hào) 25 次熱封袋包裝 50 次熱封袋包裝
SuperTOPO-Amp
Blunt 載體
LM160684-A 25 uL（其一） 50 uL（其一）
SuperTOPO-Kan
Blunt 載體
LM160684-K 25 uL（其一） 50 uL（其一）
連接緩沖液 LM160684B 25 uL 50 uL
M13F 引物 50 uL 50 uL
M13R 引物 50 uL 50 uL
超純水 100935 1 mL 1 mL
使用手冊(cè) 1 份
注意：LM160684-25A/50A 提供 SuperTOPO-Amp Blunt 載體， LM160684-25K/50K 提供 SuperTOPO-Kan Blunt 載體。 

運(yùn)輸及保存 低溫運(yùn)輸，-20℃保存，有效期一年。

自備試劑 DNA 插入片段、感受態(tài)細(xì)胞、SOB 或 LB 培養(yǎng)基（含抗菌素和不含的） 

使用方法 1. 如果是 PCR 制備插入片段，所用引物不能磷酸化，使用 pfu、KOD 等產(chǎn)

生平末端片段的高保真 DNA 聚合酶。為保證擴(kuò)增產(chǎn)物的完整性，PCR 循

環(huán)結(jié)束后，再延伸 5-10 分鐘，確保片段延伸完全。

2. 電泳檢測(cè)并相對(duì)定量 PCR 片段（跟 DNA marker 比較）。根據(jù)插入片段長(zhǎng)度和下表確定每次連接反應(yīng)需要的佳用量：

插入片段長(zhǎng)度 佳用量

100-1000 bp 20-50 ng

1000-2000 bp 50-100 ng

2000-5000 bp 100-200 ng

3. 在一個(gè)干凈的塑料離心管中，室溫下（不要放在冰上）設(shè)置如下連接反應(yīng)

體系：

成 份 用 量

純化后的 PCR 產(chǎn)物 不超過(guò) 8 uL（詳見(jiàn)注意事項(xiàng)）

SuperTOPO-Amp Blunt 載體或

SuperTOPO-Kan Blunt 載體

1 uL

連接緩沖液 1 uL

超純水 補(bǔ)到 10uL

注意：如果使用未經(jīng)純化的 PCR 產(chǎn)物，則需要加入量不能超過(guò) 1 uL，否

則 PCR 體系會(huì)干擾連接體系。

4. 輕柔吹打混勻后，短暫離心，常溫（20-30℃）放置 0-5 分鐘。如果在冬天室溫低于 20℃，建議使用 25℃水浴或金屬浴。注意：連接時(shí)間超過(guò) 5分鐘的話連接效率會(huì)降低。

5. 如果當(dāng)天不轉(zhuǎn)化，可以將離心管放-20℃保存。如果轉(zhuǎn)化，則取 5 uL 連接液加到 50-100 uL 剛剛?cè)诨母惺軕B(tài)細(xì)胞中，輕柔混勻。注意：本產(chǎn)品要求感受態(tài)細(xì)胞的轉(zhuǎn)化效率不得低于 5 x 10E7cfu/ug。

6. 如果片段長(zhǎng)度小于 2 Kb，則不需要冰浴和熱激，直接在離心管中加入 500uL 不含抗菌素的 SOC 或 LB 培養(yǎng)基，然后取 200 uL 涂盤(pán)。也可以先3000g 離心 2 分鐘后，棄掉大部分上清，只留約 100 uL 左右，然后重懸細(xì)菌后全部涂盤(pán)在含 Amp（對(duì) SuperTOPO-Amp）或 Kan（對(duì)SuperTOPO-Kan）的培養(yǎng)皿上，37℃過(guò)夜培養(yǎng)。

7. 如果片段長(zhǎng)度長(zhǎng)于 2 Kb，則按常規(guī)轉(zhuǎn)化方式，先冰浴 2-30 分鐘，然后42℃熱激 30 秒，冰上防放置 2 分鐘，再在離心管中加入 500 uL 不含抗菌素的 SOC 或 LB 培養(yǎng)基，37℃ 250 rpm 培養(yǎng) 60 分鐘，然后取 200uL 涂盤(pán)。也可以先 3000g 離心 2 分鐘后，棄掉大部分上清，只留約 100uL 左右，然后重懸細(xì)菌后全部涂盤(pán)在含 Amp（對(duì) SuperTOPO-AmpBlunt 載體）或 Kan（對(duì) SuperTOPO-Kan Blunt 載體）的培養(yǎng)皿上，37℃過(guò)夜培養(yǎng)。

8. 用 M13F/M13R 通用引物進(jìn)行菌落 PCR 或直接測(cè)序來(lái)鑒定重組子。